Nuevos métodos de administración multiplican por 20 la terapia con mRNA y permiten gene drives CRISPR en bacterias

Científicos han identificado una estrategia metabólica sencilla que mejora de forma drástica la administración de terapias con mRNA y herramientas de edición génica CRISPR, mientras que equipos de investigación independientes han desarrollado sistemas avanzados de administración para la edición génica tanto en células humanas como en poblaciones bacterianas. Según un estudio publicado en Science Translational Medicine, investigadores liderados por Daniel Zongjie Wang y Shana O. Kelley en Biohub descubrieron que administrar tres aminoácidos comunes junto con nanopartículas lipídicas (LNPs) puede aumentar la entrega de mRNA hasta 20 veces y elevar la eficiencia de edición génica con CRISPR de alrededor del 25% a casi el 90% tras un único tratamiento.

Las nanopartículas lipídicas son más conocidas como el sistema de administración utilizado en las vacunas de mRNA contra la COVID-19 administradas a miles de millones de personas en todo el mundo. Ahora los científicos exploran su potencial para transportar mRNA terapéutico al interior de las células para tratar cáncer y enfermedades inflamatorias, y para administrar herramientas de edición génica CRISPR capaces de reparar mutaciones genéticas dañinas. Un gran desafío ha frenado el avance: para que las terapias con LNP funcionen, las partículas deben liberar su carga fusionándose con las membranas celulares, un paso que ocurre con eficiencia en experimentos de laboratorio, pero de forma mucho menos fiable dentro del cuerpo humano.

Los aminoácidos metionina, arginina y serina produjeron mejoras notables cuando se añadieron junto con los tratamientos con LNP. En numerosos tipos celulares, el método incrementó la producción de la proteína diana entre cinco y 20 veces tanto en experimentos celulares como en animales vivos. El efecto fue consistente en varios métodos de administración, incluidos los de vía intramuscular, intratraqueal e intravenosa. La mejora tampoco dependió de la formulación lipídica específica ni del tipo de carga de mRNA que se estuviera administrando.

El hallazgo surgió al examinar si eran las propias células las que podían estar limitando el proceso, en lugar de centrarse en las nanopartículas. Cuando los investigadores cultivaron células en un medio especial similar al plasma humano que imita de cerca el entorno metabólico del organismo, la captación de LNP disminuyó de forma pronunciada, con una caída del 50% al 80%. Las células cultivadas en el entorno similar al plasma mostraron una actividad reducida en varias vías metabólicas relacionadas con los aminoácidos. Los investigadores concluyeron que las células dentro del cuerpo operan en condiciones metabólicas más austeras, lo que reduce su capacidad para internalizar nanopartículas.

En un experimento, los investigadores utilizaron un modelo murino de insuficiencia hepática aguda inducida por acetaminofén. Experimentos adicionales mostraron que la mezcla de aminoácidos activa una vía específica de captación celular, lo que facilita la entrada de las nanopartículas en las células.

Por separado, las partículas similares a virus diseñadas (eVLPs) han surgido como una plataforma de administración distinta que empaqueta complejos de proteína CRISPR-Cas preensamblados junto con RNA guía y los libera directamente en el citoplasma mediante fusión de membrana inspirada en virus. Este enfoque evita el tráfico endosomal y elude la expresión sostenida de nucleasas en las células receptoras, lo que da lugar a una ventana de edición más transitoria.

Desde el punto de vista estructural, las eVLPs son partículas a nanoescala de 100–200 nm de diámetro. Se ensamblan alrededor de la poliproteína retroviral Gag, que forma un núcleo de cápside interno rodeado por una envoltura lipídica derivada de la membrana de la célula productora. La producción suele realizarse en células HEK293T mediante cotransfección transitoria con plásmidos que codifican Gag, una fusión Gag–editor, el RNA guía y una glicoproteína de envoltura. Con frecuencia se utiliza la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) para conferir un amplio tropismo, mientras que alternativas como la envoltura retroviral de babuino (BaEV) pueden redirigir el direccionamiento hacia células hematopoyéticas.

La plataforma eVLP esencial para la administración de CRISPR-Cas, denominada Nanoblades, fue descrita por primera vez por Mangeot et al. en 2019 utilizando Gag del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) fusionado a Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9). Demostró edición en células primarias y en embriones de ratón in vivo. El desarrollo posterior se centró en eliminar de manera sistemática los cuellos de botella mediante versiones sucesivas de eVLPs de editores de bases (BE-eVLP).

En la versión v4, una sola inyección intravenosa logró un 63% de edición del gen Pcsk9 en el hígado de ratón, lo que se tradujo en una reducción sostenida del 78% en los niveles circulantes de la proteína PCSK9. En el sistema nervioso central, la administración local produjo hasta un 60% de edición en células transducidas, mientras que la inyección subretiniana corrigió la mutación patogénica Rpe65 en el modelo de degeneración retiniana rd12 con eficiencias de hasta el 30%, suficientes para restaurar parcialmente la función visual.

La transición a las BE-eVLPs v5 representó un cambio desde la ingeniería racional hacia la evolución dirigida basada en bibliotecas. Dado que las eVLPs carecen de genoma viral, no vinculan de forma natural genotipo y fenotipo como lo hacen los cribados de cápside de AAV. Cada mutante de la cápside Gag se etiquetó con un código de barras único incrustado en el sgRNA coempaquetado. El cribado identificó dos sustituciones cooperativas, Q226P y C507V, que remodelaron el interior de la cápside para acomodar mejor grandes cargas de RNP. En conjunto, aportaron un aumento de dos a cuatro veces en la potencia de edición respecto a v4.

La edición prime (prime editing) introdujo complejidad adicional. La proteína de fusión editor prime–transcriptasa inversa es sustancialmente mayor que los editores de bases, y el RNA guía de edición prime (pegRNA) contiene una larga extensión 3′ particularmente vulnerable a la degradación. En la PE-eVLP v3b, la fusión directa Gag–PE se sustituyó por una proteína de andamiaje más pequeña reclutada mediante una interacción de hélice enrollada (coiled-coil) para mejorar la carga del material. El sistema de aptámero MS2/MCP se sustituyó por el par COM/Com de mayor afinidad para estabilizar la captura del pegRNA. In vivo, una única inyección subretiniana corrigió aproximadamente el 15% de la mutación patogénica Mfrp en el modelo rd6.

En otra aplicación de la tecnología CRISPR, investigadores de la University of California San Diego han desarrollado un sistema de gene drive para combatir la resistencia a los antibióticos en bacterias. La resistencia a los antibióticos se ha intensificado rápidamente en los últimos años, convirtiéndose en una grave emergencia sanitaria mundial, con proyecciones que sugieren que para 2050 las superbacterias resistentes a fármacos podrían ser responsables de más de 10 millones de muertes anuales en todo el mundo.

Los profesores Ethan Bier y Justin Meyer, de la UC San Diego School of Biological Sciences, crearon un sistema Pro-Active Genetics (Pro-AG) de segunda generación llamado pPro-MobV. Esta tecnología actualizada está diseñada para propagarse a través de comunidades bacterianas e inhabilitar los genes que las hacen resistentes a los antibióticos. Según los hallazgos publicados en la revista Nature npj Antimicrobials and Resistance, los investigadores demostraron que el sistema puede viajar a través de un canal natural de apareamiento formado entre bacterias, distribuyendo los elementos que inhabilitan la resistencia en toda la población.

La base de este trabajo comenzó en 2019, cuando el laboratorio de Bier se asoció con el equipo del profesor Victor Nizet, de la UC San Diego School of Medicine, para diseñar el sistema Pro-AG original. Esa versión anterior introdujo un casete genético en bacterias, lo que le permitía copiarse entre genomas bacterianos y desactivar genes de resistencia a antibióticos. Este casete se dirige específicamente a genes de resistencia transportados en plásmidos, que son pequeñas moléculas circulares de DNA que se replican dentro de las células bacterianas. Al insertarse en estos plásmidos, el casete interrumpe los genes de resistencia y vuelve a hacer a las bacterias vulnerables a los antibióticos.

El nuevo sistema pPro-MobV amplía ese concepto al utilizar la transferencia conjugativa, un proceso similar al apareamiento bacteriano, para mover componentes CRISPR de una célula a otra. El equipo mostró que este método funciona dentro de biofilms, comunidades densas de microbios que se adhieren a superficies y que son notoriamente difíciles de eliminar con métodos estándar de limpieza. Participan en la mayoría de las infecciones graves y ayudan a las bacterias a sobrevivir al tratamiento antibiótico al formar una barrera protectora que limita la facilidad con la que los fármacos pueden penetrar.

Los investigadores también descubrieron que elementos de su sistema genético activo pueden ser transportados por bacteriófagos, o fagos, virus que infectan bacterias de manera natural. Ya se están diseñando fagos para combatir la resistencia a los antibióticos al eludir las defensas bacterianas y entregar material genético disruptivo en las células. Estas bacterias peligrosas suelen prosperar en hospitales, plantas de tratamiento de aguas residuales, explotaciones ganaderas y piscifactorías.