새 전달 방식으로 mRNA 치료 20배 향상…세균에서 CRISPR 유전자 드라이브도 가능해져

과학자들은 mRNA 치료제와 CRISPR 유전자 편집 도구의 전달을 획기적으로 개선하는 간단한 대사 전략을 확인했으며, 별도의 연구팀들은 인간 세포와 세균 집단 모두에서 유전자 편집을 위한 고도화된 전달 시스템을 개발했다. Science Translational Medicine에 게재된 연구에 따르면, Biohub의 Daniel Zongjie Wang과 Shana O. Kelley가 이끈 연구진은 지질 나노입자(LNPs)와 함께 흔한 아미노산 3가지를 투여하면 mRNA 전달이 최대 20배 증가하고, 1회 치료 후 CRISPR 유전자 편집 효율이 약 25%에서 거의 90%로 상승할 수 있음을 발견했다.

지질 나노입자는 전 세계 수십억 명에게 투여된 COVID-19 mRNA 백신에서 사용된 전달 시스템으로 가장 잘 알려져 있다. 과학자들은 현재 암과 염증성 질환을 치료하기 위해 치료용 mRNA를 세포 내로 운반하고, 유해한 유전적 돌연변이를 복구할 수 있는 CRISPR 유전자 편집 도구를 전달하는 데 LNP의 잠재력을 탐구하고 있다. 그러나 중요한 난제가 진전을 더디게 해왔다. LNP 치료가 작동하려면 입자가 세포막과 융합해 적재물(cargo)을 방출해야 하는데, 이 단계는 실험실 조건에서는 효율적으로 일어나지만 인체 내부에서는 훨씬 덜 안정적으로 발생한다.

메티오닌, 아르지닌, 세린 아미노산은 LNP 치료와 함께 추가했을 때 극적인 개선을 보였다. 다양한 유형의 세포 전반에서 이 방법은 세포 실험과 생체 동물 모두에서 표적 단백질 생성량을 5~20배 증가시켰다. 이 효과는 근육내, 기관내, 정맥내 투여를 포함한 여러 전달 방식에서 일관되게 나타났다. 또한 특정 지질 제형이나 전달되는 mRNA 적재물의 종류에 의존하지 않았다.

이번 발견은 나노입자 자체에 초점을 맞추기보다 세포가 과정의 제한 요인일 수 있는지를 살피는 과정에서 나왔다. 연구진이 체내 대사 환경을 밀접하게 모사하는 특수한 인간 혈장 유사 배지에서 세포를 배양하자 LNP 흡수(uptake)가 급격히 감소해 50~80% 떨어졌다. 혈장 유사 환경에서 자란 세포는 아미노산과 관련된 여러 대사 경로의 활성이 감소해 있었다. 연구진은 체내의 세포가 더 제한적인 대사 조건에서 작동하며, 이로 인해 나노입자를 세포 내부로 들여보내는 능력이 감소한다고 결론지었다.

한 실험에서 연구진은 아세트아미노펜 유발 급성 간부전의 마우스 모델을 사용했다. 추가 실험에서는 아미노산 혼합물이 특정한 세포 흡수 경로를 활성화해 나노입자가 세포로 더 쉽게 들어가도록 만든다는 점이 확인됐다.

한편, 엔지니어링된 바이러스 유사 입자(eVLPs)는 가이드 RNA와 함께 미리 조립된 CRISPR-Cas 단백질 복합체를 포장하고, 바이러스에서 영감을 받은 막 융합을 통해 이를 세포질로 직접 방출하는 별도의 전달 플랫폼으로 부상했다. 이 접근법은 엔도솜(endosome) 수송 경로를 우회하고 수용 세포에서 뉴클레아제의 지속적 발현을 피함으로써, 더 일시적인 편집 창(editing window)을 제공한다.

구조적으로 eVLPs는 직경 100–200 nm의 나노스케일 입자다. eVLPs는 내부 캡시드 코어를 형성하는 레트로바이러스 Gag 폴리단백질을 중심으로 조립되며, 그 바깥은 생산자 세포막에서 유래한 지질 외피(lipid envelope)로 둘러싸여 있다. 생산은 보통 HEK293T 세포에서 Gag, Gag–편집기(editor) 융합체, 가이드 RNA, 외피 당단백질을 암호화하는 플라스미드를 일시적 공동 형질도입(co-transfection)해 이뤄진다. 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G)은 광범위한 감염성(tropism)을 부여하기 위해 흔히 사용되며, 개코원숭이 레트로바이러스 외피(BaEV) 같은 대안은 조혈계 세포(haematopoietic cells) 쪽으로 표적화를 재지정할 수 있다.

CRISPR-Cas 전달을 위한 핵심 eVLP 플랫폼인 Nanoblades는 2019년 Mangeot 등(Mangeot et al.)이 Moloney murine leukaemia virus(MMLV) Gag를 Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)과 융합해 처음 기술했다. 이 플랫폼은 1차 세포와 생체 내 마우스 배아에서의 편집을 입증했다. 이후 개발은 연속적인 베이스 에디터 eVLP(BE-eVLP) 버전을 통해 병목을 체계적으로 제거하는 데 초점을 맞췄다.

v4에서는 1회 정맥 주사만으로 마우스 간에서 Pcsk9 유전자의 63% 편집이 달성됐고, 그 결과 혈중 PCSK9 단백질 수치가 지속적으로 78% 감소했다. 중추신경계에서는 국소 투여가 형질도입된 세포에서 최대 60%의 편집을 유도했으며, 망막하(subretinal) 주사는 rd12 망막변성 모델에서 병적 Rpe65 돌연변이를 최대 30%의 효율로 교정해 부분적인 시각 기능 회복에 충분했다.

v5 BE-eVLPs로의 전환은 합리적 공학(rational engineering)에서 라이브러리 기반 지향 진화(directed evolution)로의 이동을 의미했다. eVLPs는 바이러스 유전체가 없어 AAV 캡시드 스크리닝처럼 유전형과 표현형을 자연스럽게 연결하지 못한다. 각 Gag 캡시드 변이체는 공동 포장된 sgRNA 내부에 포함된 고유 바코드로 표지됐다. 스크리닝 결과, Q226P와 C507V라는 두 가지 협동적 치환(substitution)이 확인됐으며, 이들은 캡시드 내부를 재구성해 큰 RNP 적재물을 더 잘 수용하도록 했다. 두 변이는 함께 v4 대비 편집 효능을 2~4배 증가시켰다.

프라임 에디팅(prime editing)은 추가적인 복잡성을 도입했다. 프라임 에디터–역전사효소 융합 단백질은 베이스 에디터보다 상당히 크고, 프라임 에디팅 가이드 RNA(pegRNA)는 분해에 특히 취약한 긴 3′ 연장을 포함한다. v3b PE-eVLP에서는 적재물 로딩을 개선하기 위해 직접적인 Gag–PE 융합을 코일드-코일 상호작용을 통해 모집되는 더 작은 스캐폴드 단백질로 대체했다. 또한 pegRNA 포획을 안정화하기 위해 MS2/MCP 아프타머 시스템을 더 높은 친화도의 COM/Com 쌍으로 교체했다. 생체 내에서는 1회 망막하 주사로 rd6 모델에서 병적 Mfrp 돌연변이의 약 15%가 교정됐다.

CRISPR 기술의 별도 응용으로, University of California San Diego 연구진은 세균에서 항생제 내성에 대응하기 위한 유전자 드라이브(gene drive) 시스템을 개발했다. 항생제 내성은 최근 수년간 빠르게 악화돼 심각한 글로벌 보건 비상사태로 커졌으며, 2050년까지 약물 내성 슈퍼버그가 전 세계적으로 매년 1,000만 명 이상의 사망에 책임을 질 수 있다는 전망도 제시된다.

UC San Diego School of Biological Sciences의 Ethan Bier와 Justin Meyer 교수는 pPro-MobV라 불리는 2세대 Pro-Active Genetics(Pro-AG) 시스템을 만들었다. 이 업데이트된 기술은 세균 군집 전반으로 퍼져 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자를 비활성화하도록 설계됐다. Nature 저널 npj Antimicrobials and Resistance에 발표된 결과에 따르면, 연구진은 이 시스템이 세균 사이에 형성되는 자연 교미 채널을 통해 이동하며, 내성 비활성화 요소를 집단 전체에 분산시킬 수 있음을 입증했다.

이 연구의 토대는 2019년에 마련됐다. Bier 연구실은 UC San Diego School of Medicine의 Victor Nizet 교수팀과 협력해 원래의 Pro-AG 시스템을 설계했다. 초기 버전은 세균에 유전 카세트(genetic cassette)를 도입해 세균 유전체 사이에서 스스로 복제되도록 하고 항생제 내성 유전자를 차단할 수 있게 했다. 이 카세트는 플라스미드(plasmid)에 실린 내성 유전자를 특정 표적으로 삼는다. 플라스미드는 세균 세포 내에서 복제되는 작은 원형 DNA 분자다. 카세트가 이 플라스미드에 삽입되면 내성 유전자가 교란돼 세균이 다시 항생제에 취약해진다.

새로운 pPro-MobV 시스템은 세균의 교미와 유사한 과정인 접합 전달(conjugal transfer)을 이용해 CRISPR 구성요소를 한 세포에서 다른 세포로 이동시키는 방식으로 이 개념을 확장했다. 연구팀은 이 방법이 바이오필름(biofilms) 내부에서도 작동함을 보여줬다. 바이오필름은 표면에 달라붙는 고밀도 미생물 군집으로, 표준적인 세척 방법으로 제거하기가 악명 높게 어렵다. 바이오필름은 대부분의 중증 감염에 관여하며, 약물이 얼마나 쉽게 침투할 수 있는지를 제한하는 보호 장벽을 형성해 세균이 항생제 치료를 견디도록 돕는다.

연구진은 또한 활성 유전 시스템의 구성요소가 박테리오파지(bacteriophage), 즉 파지(phage)로도 운반될 수 있음을 발견했다. 파지는 세균을 자연적으로 감염시키는 바이러스다. 파지는 이미 세균의 방어를 우회해 교란성 유전 물질을 세포로 전달함으로써 항생제 내성과 싸우도록 공학적으로 설계되고 있다. 이러한 위험한 세균은 병원, 하·폐수 처리 시설, 축산 현장, 양식장 등에서 종종 번성한다.