新型递送方式使mRNA治疗递送效率提升20倍，并在细菌中实现CRISPR基因驱动

科学家发现了一种简单的代谢策略，可显著提升mRNA疗法和CRISPR基因编辑工具的递送效果；与此同时，其他研究团队也开发出面向人类细胞与细菌群体的更先进基因编辑递送系统。根据发表在《Science Translational Medicine》的一项研究，Biohub的Daniel Zongjie Wang和Shana O. Kelley团队发现，将三种常见氨基酸与脂质纳米颗粒（LNPs）一同给药，可使mRNA递送最高提升20倍，并在单次治疗后将CRISPR基因编辑效率从约25%提高到接近90%。

脂质纳米颗粒最为人所熟知的用途，是作为COVID-19 mRNA疫苗的递送系统，为全球数十亿人接种。如今，科学家正探索其将治疗性mRNA递送入细胞以治疗癌症和炎症性疾病的潜力，并用于递送可修复有害遗传突变的CRISPR基因编辑工具。然而，一项关键挑战拖慢了进展：要让LNP疗法奏效，这些颗粒必须通过与细胞膜融合来释放其载荷——这一步在实验室实验中效率很高，但在人体内的可靠性要低得多。

在LNP治疗中加入蛋氨酸、精氨酸和丝氨酸，可带来显著改善。在多种细胞类型中，该方法在细胞实验和活体动物中均可使靶蛋白产生量提高5到20倍。该效应在多种给药方式下保持一致，包括肌内、气管内以及静脉给药。改善效果也不依赖于特定的脂质配方或所递送mRNA载荷的类型。

这一发现源自研究人员对“限制因素可能来自细胞本身而非纳米颗粒”的检验。当研究人员将细胞培养在一种特殊的人血浆样培养基中——该培养基可高度模拟机体的代谢环境——LNP摄取量显著下降，降低幅度达50%至80%。在血浆样环境中生长的细胞在若干与氨基酸相关的代谢通路上活性降低。研究人员据此认为，体内细胞处于更为“节俭”的代谢条件下，从而降低了其内吞纳米颗粒的能力。

在一项实验中，研究人员使用了对乙酰氨基酚诱导急性肝衰竭的小鼠模型。进一步实验显示，这一氨基酸混合物可激活特定的细胞摄取通路，使纳米颗粒更容易进入细胞。

另一方面，工程化病毒样颗粒（eVLPs）作为一种独立的递送平台正在兴起：它们将预先组装的CRISPR-Cas蛋白复合物与引导RNA一同封装，并通过受病毒启发的膜融合将其直接释放到细胞质中。该策略绕开内体运输，并避免在受体细胞中持续表达核酸酶，从而形成更为短暂的编辑窗口。

从结构上看，eVLPs为直径100–200 nm的纳米级颗粒。其围绕逆转录病毒Gag多蛋白组装，形成内侧衣壳核心，外部包裹一层来源于生产者细胞膜的脂质包膜。eVLPs通常在HEK293T细胞中生产，通过瞬时共转染编码Gag、Gag–编辑器融合蛋白、引导RNA以及包膜糖蛋白的质粒实现。常用水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）以赋予广泛嗜性；而狒狒逆转录病毒包膜（BaEV）等替代方案则可将靶向性重新定向至造血细胞。

用于CRISPR-Cas递送的关键eVLP平台称为Nanoblades，最早由Mangeot等人在2019年描述：其采用Moloney小鼠白血病病毒（MMLV）Gag与Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）融合。该平台在原代细胞以及体内小鼠胚胎中均展示了编辑效果。后续开发聚焦于通过连续迭代的碱基编辑器eVLP（BE-eVLP）版本，系统性清除瓶颈。

在v4版本中，单次静脉注射即可在小鼠肝脏实现Pcsk9基因63%的编辑率，并使循环PCSK9蛋白水平持续降低78%。在中枢神经系统中，局部给药可在转导细胞中实现最高60%的编辑率；而视网膜下注射可在rd12视网膜变性模型中纠正致病性Rpe65突变，效率最高达30%，足以恢复部分视觉功能。

向v5 BE-eVLPs的过渡，标志着从理性工程转向基于文库的定向进化。由于eVLPs不含病毒基因组，其不像AAV衣壳筛选那样天然实现基因型与表型的关联。研究人员为每个Gag衣壳突变体添加了独特条形码，并将其嵌入共同封装的sgRNA中。筛选鉴定出两处协同替换Q226P和C507V，可重塑衣壳内部结构以更好容纳大型RNP载荷。二者共同使编辑效力较v4提升2到4倍。

Prime editing带来了额外复杂性。Prime editor–逆转录酶融合蛋白明显大于碱基编辑器，而prime editing引导RNA（pegRNA）包含较长的3′延伸段，尤其易被降解。在v3b PE-eVLP中，研究人员以通过卷曲螺旋相互作用招募的较小支架蛋白，取代直接的Gag–PE融合，以改善载荷装载。MS2/MCP适配体系统被亲和力更高的COM/Com对取代，以稳定pegRNA捕获。在体内，单次视网膜下注射可在rd6模型中纠正约15%的致病性Mfrp突变。

在CRISPR技术的另一项应用中，加州大学圣迭戈分校的研究人员开发了一种基因驱动系统，用于对抗细菌的抗生素耐药性。近年来，抗生素耐药性迅速升级为严重的全球卫生紧急事件；预测显示，到2050年，耐药“超级细菌”每年可能在全球造成超过1,000万例死亡。

UC San Diego生物科学学院的Ethan Bier和Justin Meyer教授创建了第二代Pro-Active Genetics（Pro-AG）系统，命名为pPro-MobV。这项升级技术旨在在细菌群落中传播，并使其产生抗生素耐药性的基因失活。根据发表在《Nature》期刊npj Antimicrobials and Resistance的研究结果，研究人员证明该系统能够通过细菌之间形成的天然“交配通道”传播，将使耐药失活的元件分发到整个群体。

这项工作的基础始于2019年，当时Bier实验室与UC San Diego医学院Victor Nizet教授团队合作，设计了最初的Pro-AG系统。早期版本向细菌引入一个遗传盒（genetic cassette），使其能够在细菌基因组之间自我复制，并关闭抗生素耐药基因。该遗传盒特异性靶向位于质粒上的耐药基因；质粒是可在细菌细胞内复制的小型环状DNA分子。通过插入这些质粒，该遗传盒可破坏耐药基因，使细菌再次对抗生素敏感。

更新后的pPro-MobV系统在此概念上更进一步：利用接合转移（conjugal transfer）——一种类似细菌交配的过程——将CRISPR组分从一个细胞转移到另一个细胞。团队显示，该方法可在生物膜内发挥作用。生物膜是附着于表面的致密微生物群落，以难以用标准清洁方法清除而著称。生物膜参与多数严重感染，并通过形成限制药物渗透的保护屏障，帮助细菌在抗生素治疗中存活。

研究人员还发现，其主动遗传系统的相关元件可由噬菌体（bacteriophage，或phage）运输——噬菌体是一类天然感染细菌的病毒。噬菌体已被用于工程化对抗抗生素耐药性，可绕过细菌防御并将干扰性的遗传物质递送入细胞。这类危险细菌常在医院、污水处理设施、畜牧业生产以及鱼类养殖场中滋生。