Neue Verabreichungsmethoden steigern mRNA-Therapien um das 20-Fache und ermöglichen CRISPR-Gene-Drives in Bakterien
Forschende berichten über mehrere Durchbrüche bei Verabreichungssystemen für mRNA-Therapien und CRISPR-Geneditierung. Eine Kombination aus drei Aminosäuren kann die LNP-vermittelte mRNA-Zustellung um bis zu das 20-Fache steigern, während eVLPs und ein bakterieller Gene-Drive-Ansatz neue Wege zur effizienten Editierung und zur Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen eröffnen.
Wissenschaftler haben eine einfache metabolische Strategie identifiziert, die die Verabreichung von mRNA-Therapien und CRISPR-Geneditierungswerkzeugen drastisch verbessert, während separate Forschungsteams fortgeschrittene Verabreichungssysteme für Geneditierung sowohl in menschlichen Zellen als auch in bakteriellen Populationen entwickelt haben. Laut einer in Science Translational Medicine veröffentlichten Studie fanden Forschende um Daniel Zongjie Wang und Shana O. Kelley am Biohub heraus, dass die Gabe von drei gängigen Aminosäuren zusammen mit Lipidnanopartikeln (LNPs) die mRNA-Zustellung um bis zu das 20-Fache erhöhen und die Effizienz der CRISPR-Geneditierung nach einer einzigen Behandlung von etwa 25 Prozent auf nahezu 90 Prozent steigern kann.
Lipidnanopartikel sind vor allem als das Verabreichungssystem bekannt, das in den COVID-19-mRNA-Impfstoffen verwendet wurde, die weltweit Milliarden Menschen erhalten haben. Wissenschaftler erkunden nun ihr Potenzial, therapeutische mRNA in Zellen einzuschleusen, um Krebs und entzündliche Erkrankungen zu behandeln, und CRISPR-Geneditierungswerkzeuge zu liefern, die schädliche genetische Mutationen reparieren können. Eine zentrale Herausforderung hat den Fortschritt gebremst: Damit LNP-Therapien funktionieren, müssen die Partikel ihre Fracht durch Fusion mit Zellmembranen freisetzen – ein Schritt, der in Laborexperimenten effizient abläuft, im menschlichen Körper jedoch deutlich weniger zuverlässig.
Die Aminosäuren Methionin, Arginin und Serin führten zu dramatischen Verbesserungen, wenn sie zusätzlich zu LNP-Behandlungen gegeben wurden. Über viele Zelltypen hinweg erhöhte die Methode die Produktion des Zielproteins in Zellversuchen und in lebenden Tieren um das Fünf- bis 20-Fache. Der Effekt war über mehrere Verabreichungswege hinweg konsistent, darunter intramuskuläre, intratracheale und intravenöse Applikation. Die Verbesserung hing zudem weder von der spezifischen Lipidformulierung noch von der Art der transportierten mRNA-Fracht ab.
Der Befund entstand aus der Frage, ob nicht die Zellen selbst den Prozess limitieren könnten, statt den Fokus ausschließlich auf die Nanopartikel zu richten. Als Forschende Zellen in einem speziellen, menschlichem Plasma nachempfundenen Medium kultivierten, das die metabolische Umgebung des Körpers eng nachbildet, fiel die LNP-Aufnahme stark ab – um 50 bis 80 Prozent. Zellen, die in der plasmaähnlichen Umgebung wuchsen, zeigten eine verringerte Aktivität in mehreren aminosäurebezogenen Stoffwechselwegen. Die Forschenden schlossen daraus, dass Zellen im Körper unter „magereren“ metabolischen Bedingungen arbeiten, was ihre Fähigkeit zur Internalisierung von Nanopartikeln reduziert.
In einem Experiment nutzten die Forschenden ein Mausmodell eines durch Acetaminophen ausgelösten akuten Leberversagens. Weitere Experimente zeigten, dass die Aminosäuremischung einen spezifischen zellulären Aufnahmepfad aktiviert, wodurch Nanopartikel leichter in die Zellen gelangen.
Unabhängig davon haben sich engineered virus-like particles (eVLPs) als eigenständige Verabreichungsplattform etabliert: Sie verpacken vorassemblierte CRISPR-Cas-Proteinkomplexe zusammen mit guide RNA und setzen diese über eine von Viren inspirierte Membranfusion direkt in das Zytoplasma frei. Dieser Ansatz umgeht das endosomale Trafficking und vermeidet eine anhaltende Nuklease-Expression in Empfängerzellen, was zu einem eher transienten Editierzeitfenster führt.
Strukturell sind eVLPs nanoskalige Partikel mit einem Durchmesser von 100–200 nm. Sie assemblieren um das retrovirale Gag-Polyprotein, das einen inneren Kapsidkern bildet, der von einer Lipidhülle umgeben ist, die von der Membran der produzierenden Zelle stammt. Die Produktion erfolgt typischerweise in HEK293T-Zellen durch transiente Co-Transfektion mit Plasmiden, die für Gag, eine Gag–Editor-Fusion, die guide RNA und ein Hüllglykoprotein kodieren. Häufig wird das Vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) eingesetzt, um einen breiten Tropismus zu vermitteln, während Alternativen wie die baboon retroviral envelope (BaEV) das Targeting in Richtung hämatopoetischer Zellen umlenken können.
Die grundlegende eVLP-Plattform für die CRISPR-Cas-Zustellung, Nanoblades genannt, wurde erstmals 2019 von Mangeot et al. beschrieben, wobei Moloney murine leukaemia virus (MMLV) Gag mit Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) fusioniert wurde. Sie demonstrierte Editierung in Primärzellen und in Maus-Embryonen in vivo. Die nachfolgende Entwicklung konzentrierte sich darauf, Engpässe systematisch durch aufeinanderfolgende base editor eVLP (BE-eVLP)-Versionen zu beseitigen.
Mit v4 erreichte eine einzelne intravenöse Injektion 63% Editierung des Pcsk9-Gens in der Mausleber, was zu einer anhaltenden Reduktion der zirkulierenden PCSK9-Proteinspiegel um 78% führte. Im zentralen Nervensystem erzeugte eine lokale Applikation bis zu 60% Editierung in transduzierten Zellen, während eine subretinale Injektion die pathogene Rpe65-Mutation im rd12-Netzhautdegenerationsmodell mit Effizienzen von bis zu 30 Prozent korrigierte – ausreichend, um eine teilweise Sehleistung wiederherzustellen.
Der Übergang zu v5 BE-eVLPs markierte einen Wechsel von rationalem Engineering hin zu bibliotheksbasierter gerichteter Evolution. Da eVLPs kein virales Genom besitzen, verknüpfen sie Genotyp und Phänotyp nicht auf natürliche Weise, wie es AAV-Kapsid-Screens tun. Jede Gag-Kapsidmutante wurde mit einem einzigartigen Barcode markiert, der in die co-verpackte sgRNA eingebettet war. Das Screening identifizierte zwei kooperative Substitutionen, Q226P und C507V, die das Kapsidinnere so umgestalteten, dass große RNP-Frachten besser aufgenommen werden konnten. Zusammen lieferten sie eine zwei- bis vierfache Steigerung der Editierpotenz gegenüber v4.
Prime Editing brachte zusätzliche Komplexität mit sich. Das Prime-Editor–Reverse-Transkriptase-Fusionsprotein ist deutlich größer als Base-Editoren, und die prime editing guide RNA (pegRNA) enthält eine lange 3′-Extension, die besonders anfällig für Abbau ist. In der v3b PE-eVLP wurde die direkte Gag–PE-Fusion durch ein kleineres Scaffold-Protein ersetzt, das über eine Coiled-Coil-Interaktion rekrutiert wird, um die Beladung zu verbessern. Das MS2/MCP-Aptamersystem wurde durch das höher affine COM/Com-Paar substituiert, um das Einfangen der pegRNA zu stabilisieren. In vivo korrigierte eine einzelne subretinale Injektion etwa 15% der pathogenen Mfrp-Mutation im rd6-Modell.
In einer separaten Anwendung der CRISPR-Technologie haben Forschende an der University of California San Diego ein Gene-Drive-System entwickelt, um Antibiotikaresistenzen in Bakterien zu bekämpfen. Antibiotikaresistenz hat sich in den letzten Jahren rasch verschärft und sich zu einem ernsten globalen Gesundheitsnotstand entwickelt; Prognosen zufolge könnten bis 2050 arzneimittelresistente „Superbugs“ weltweit jährlich für mehr als 10 Millionen Todesfälle verantwortlich sein.
Die Professoren Ethan Bier und Justin Meyer von der UC San Diego School of Biological Sciences entwickelten ein Pro-Active Genetics (Pro-AG)-System der zweiten Generation namens pPro-MobV. Diese aktualisierte Technologie soll sich in bakteriellen Gemeinschaften ausbreiten und die Gene deaktivieren, die Bakterien gegen Antibiotika resistent machen. Laut in der Nature-Zeitschrift npj Antimicrobials and Resistance veröffentlichten Ergebnissen zeigten die Forschenden, dass das System über einen natürlichen „Mating Channel“ zwischen Bakterien wandern kann und so die resistenzdeaktivierenden Elemente in Populationen verteilt.
Die Grundlage für diese Arbeiten wurde 2019 gelegt, als Biers Labor mit dem Team von Professor Victor Nizet an der UC San Diego School of Medicine zusammenarbeitete, um das ursprüngliche Pro-AG-System zu entwerfen. Diese frühere Version brachte eine genetische Kassette in Bakterien ein, die es ihr ermöglichte, sich zwischen bakteriellen Genomen zu kopieren und Antibiotikaresistenzgene auszuschalten. Diese Kassette zielt spezifisch auf Resistenzgene ab, die auf Plasmiden getragen werden – kleinen zirkulären DNA-Molekülen, die sich in bakteriellen Zellen replizieren. Durch das Einfügen in diese Plasmide stört die Kassette die Resistenzgene und macht die Bakterien wieder anfällig für Antibiotika.
Das neuere pPro-MobV-System baut auf diesem Konzept auf, indem es conjugal transfer nutzt – einen der bakteriellen Paarung ähnlichen Prozess –, um CRISPR-Komponenten von einer Zelle zur nächsten zu bewegen. Das Team zeigte, dass diese Methode innerhalb von Biofilmen funktioniert, dichten mikrobiellen Gemeinschaften, die an Oberflächen haften und bekanntermaßen mit Standardreinigungsmethoden nur schwer zu beseitigen sind. Sie sind an den meisten schweren Infektionen beteiligt und helfen Bakterien, eine Antibiotikabehandlung zu überstehen, indem sie eine Schutzbarriere bilden, die begrenzt, wie leicht Arzneistoffe eindringen können.
Die Forschenden fanden zudem heraus, dass Elemente ihres aktiven genetischen Systems durch Bakteriophagen oder Phagen transportiert werden können – Viren, die Bakterien auf natürliche Weise infizieren. Phagen werden bereits so entwickelt, dass sie Antibiotikaresistenzen bekämpfen, indem sie bakterielle Abwehrmechanismen umgehen und störendes genetisches Material in Zellen einschleusen. Diese gefährlichen Bakterien gedeihen häufig in Krankenhäusern, Abwasserbehandlungsanlagen, in der Nutztierhaltung und in Fischfarmen.