Novos métodos de entrega aumentam em 20 vezes terapias com mRNA e viabilizam gene drives de CRISPR em bactérias

Cientistas identificaram uma estratégia metabólica simples que melhora de forma dramática a entrega de terapias com mRNA e ferramentas de edição gênica por CRISPR, enquanto equipes de pesquisa separadas desenvolveram sistemas avançados de entrega para edição gênica tanto em células humanas quanto em populações bacterianas. De acordo com um estudo publicado na Science Translational Medicine, pesquisadores liderados por Daniel Zongjie Wang e Shana O. Kelley no Biohub descobriram que administrar três aminoácidos comuns junto com nanopartículas lipídicas (LNPs) pode aumentar a entrega de mRNA em até 20 vezes e elevar a eficiência de edição gênica por CRISPR de cerca de 25% para quase 90% após um único tratamento.

As nanopartículas lipídicas são mais conhecidas como o sistema de entrega usado nas vacinas de mRNA contra COVID-19 aplicadas em bilhões de pessoas no mundo. Agora, cientistas exploram seu potencial para transportar mRNA terapêutico para dentro das células a fim de tratar câncer e doenças inflamatórias, além de entregar ferramentas de edição gênica por CRISPR capazes de reparar mutações genéticas prejudiciais. Um grande desafio tem desacelerado o progresso: para as terapias com LNP funcionarem, as partículas precisam liberar sua carga ao se fundirem com as membranas celulares — uma etapa que ocorre com eficiência em experimentos de laboratório, mas de forma muito menos confiável dentro do corpo humano.

Os aminoácidos metionina, arginina e serina produziram melhorias marcantes quando adicionados junto aos tratamentos com LNP. Em diversos tipos de células, o método aumentou a produção da proteína-alvo em cinco a 20 vezes, tanto em experimentos celulares quanto em animais vivos. O efeito foi consistente em várias vias de administração, incluindo intramuscular, intratraqueal e intravenosa. A melhora também não dependeu da formulação lipídica específica nem do tipo de carga de mRNA entregue.

A descoberta surgiu ao investigar se as próprias células poderiam estar limitando o processo, em vez de focar nas nanopartículas. Quando os pesquisadores cultivaram células em um meio especial semelhante ao plasma humano, que imita de perto o ambiente metabólico do organismo, a captação de LNP caiu acentuadamente, reduzindo-se em 50% a 80%. Células cultivadas nesse ambiente semelhante ao plasma mostraram atividade reduzida em diversas vias metabólicas relacionadas a aminoácidos. Os pesquisadores concluíram que as células dentro do corpo operam sob condições metabólicas mais restritas, o que reduz sua capacidade de internalizar nanopartículas.

Em um experimento, os pesquisadores usaram um modelo em camundongos de insuficiência hepática aguda induzida por acetaminofeno. Experimentos adicionais mostraram que a mistura de aminoácidos ativa uma via específica de captação celular, facilitando a entrada de nanopartículas nas células.

Separadamente, partículas semelhantes a vírus engenheiradas (eVLPs) emergiram como uma plataforma distinta de entrega que empacota complexos proteicos CRISPR-Cas pré-montados, junto com RNA guia, e os libera diretamente no citoplasma por meio de fusão de membrana inspirada em vírus. Essa abordagem contorna o tráfego endossomal e evita a expressão sustentada de nuclease nas células receptoras, resultando em uma janela de edição mais transitória.

Estruturalmente, as eVLPs são partículas em escala nanométrica com 100–200 nm de diâmetro. Elas se montam ao redor da poliproteína Gag retroviral, que forma um núcleo de capsídeo interno envolto por um envelope lipídico derivado da membrana celular produtora. A produção geralmente ocorre em células HEK293T por meio de co-transfecção transitória com plasmídeos que codificam Gag, uma fusão Gag–editor, o RNA guia e uma glicoproteína de envelope. A glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) é comumente usada para conferir amplo tropismo, enquanto alternativas como o envelope retroviral de babuíno (BaEV) podem redirecionar o alvo para células hematopoéticas.

A plataforma essencial de eVLP para entrega de CRISPR-Cas, chamada Nanoblades, foi descrita pela primeira vez por Mangeot et al. em 2019 usando Gag do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV) fundido à Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9). Ela demonstrou edição em células primárias e em embriões de camundongo in vivo. O desenvolvimento subsequente concentrou-se em remover sistematicamente gargalos por meio de versões sucessivas de eVLP de editor de bases (BE-eVLP).

Na versão v4, uma única injeção intravenosa alcançou 63% de edição do gene Pcsk9 no fígado de camundongos, resultando em uma redução sustentada de 78% nos níveis circulantes da proteína PCSK9. No sistema nervoso central, a administração local produziu até 60% de edição nas células transduzidas, enquanto a injeção sub-retiniana corrigiu a mutação patogênica Rpe65 no modelo de degeneração retiniana rd12 com eficiências de até 30%, suficiente para restaurar parcialmente a função visual.

A transição para as BE-eVLPs v5 representou uma mudança da engenharia racional para a evolução dirigida baseada em bibliotecas. Como as eVLPs não têm um genoma viral, elas não vinculam naturalmente genótipo e fenótipo como ocorre em triagens de capsídeo de AAV. Cada mutante de capsídeo Gag foi marcado com um código de barras único incorporado ao sgRNA coempacotado. A triagem identificou duas substituições cooperativas, Q226P e C507V, que remodelaram o interior do capsídeo para acomodar melhor grandes cargas de RNP. Em conjunto, elas proporcionaram um aumento de duas a quatro vezes na potência de edição em relação à v4.

A prime editing introduziu complexidade adicional. A proteína de fusão prime editor–transcriptase reversa é substancialmente maior do que editores de base, e o RNA guia de prime editing (pegRNA) contém uma longa extensão 3′ particularmente vulnerável à degradação. Na v3b PE-eVLP, a fusão direta Gag–PE foi substituída por uma proteína de arcabouço menor, recrutada por meio de uma interação do tipo coiled-coil para melhorar o carregamento da carga. O sistema de aptâmero MS2/MCP foi substituído pelo par COM/Com, de maior afinidade, para estabilizar a captura de pegRNA. In vivo, uma única injeção sub-retiniana corrigiu aproximadamente 15% da mutação patogênica Mfrp no modelo rd6.

Em uma aplicação separada da tecnologia CRISPR, pesquisadores da University of California San Diego desenvolveram um sistema de gene drive para combater a resistência a antibióticos em bactérias. A resistência a antibióticos se intensificou rapidamente nos últimos anos, transformando-se em uma grave emergência global de saúde, com projeções sugerindo que, até 2050, superbactérias resistentes a medicamentos podem ser responsáveis por mais de 10 milhões de mortes por ano no mundo.

Os professores Ethan Bier e Justin Meyer, da UC San Diego School of Biological Sciences, criaram um sistema de Pro-Active Genetics (Pro-AG) de segunda geração chamado pPro-MobV. Essa tecnologia atualizada foi projetada para se disseminar por comunidades bacterianas e desativar os genes que as tornam resistentes a antibióticos. De acordo com resultados publicados na revista Nature npj Antimicrobials and Resistance, os pesquisadores demonstraram que o sistema pode viajar por um canal natural de acasalamento formado entre bactérias, distribuindo os elementos que desativam a resistência por toda a população.

A base desse trabalho começou em 2019, quando o laboratório de Bier fez parceria com a equipe do professor Victor Nizet, da UC San Diego School of Medicine, para projetar o sistema Pro-AG original. A versão anterior introduziu um cassette genético nas bactérias, permitindo que ele se copiasse entre genomas bacterianos e desligasse genes de resistência a antibióticos. Esse cassette tem como alvo específico genes de resistência carregados em plasmídeos, que são pequenas moléculas circulares de DNA que se replicam dentro das células bacterianas. Ao se inserir nesses plasmídeos, o cassette interrompe os genes de resistência e torna as bactérias novamente vulneráveis aos antibióticos.

O novo sistema pPro-MobV amplia esse conceito ao usar transferência conjugativa, um processo semelhante ao acasalamento bacteriano, para mover componentes de CRISPR de uma célula para outra. A equipe mostrou que esse método funciona dentro de biofilmes — comunidades densas de microrganismos que aderem a superfícies e são notoriamente difíceis de eliminar com métodos padrão de limpeza. Eles estão envolvidos na maioria das infecções graves e ajudam as bactérias a sobreviver ao tratamento com antibióticos ao formar uma barreira protetora que limita o quão facilmente os medicamentos conseguem penetrar.

Os pesquisadores também descobriram que elementos de seu sistema genético ativo podem ser transportados por bacteriófagos, ou fagos, vírus que infectam bactérias naturalmente. Fagos já estão sendo engenheirados para combater a resistência a antibióticos ao contornar as defesas bacterianas e entregar material genético disruptivo às células. Essas bactérias perigosas frequentemente prosperam em hospitais, estações de tratamento de águas residuais, operações pecuárias e fazendas de peixes.