La edición génica con transposasas muestra alta eficiencia en la biofabricación y el mejoramiento vegetal

Los sistemas de edición génica basados en transposasas están demostrando ventajas significativas frente a CRISPR-Cas9 tanto en la fabricación biofarmacéutica como en aplicaciones de mejoramiento vegetal, según investigaciones recientes y desarrollos de la industria. La tecnología, basada en los «genes saltadores» descubiertos por la premio Nobel Barbara McClintock, está abordando limitaciones clave de los enfoques tradicionales de edición génica.

En la fabricación biofarmacéutica, sistemas de transposones como Leap-In Transposase y la transposasa piggyBac se han adoptado para la ingeniería de células de ovario de hámster chino (Chinese Hamster Ovary, CHO), que han servido como el principal huésped mamífero para la producción de biofármacos desde la década de 1980. El primer producto derivado de CHO fue aprobado por la FDA en 1987. Las transposasas ofrecen dos ventajas críticas frente a las nucleasas dirigidas: integraciones multicopia a lo largo del genoma CHO y alta eficiencia de transposición, lo que se traduce en poblaciones celulares homogéneas altamente productivas.

La enzima transposasa suele requerir solo una secuencia diana corta (p. ej., TTAA) y una región de cromatina abierta, lo que da como resultado entre 2 y 50 copias de integración por genoma CHO. La integridad del ADN transpuesto se mantiene de forma estable en cada sitio de integración. Esto contrasta marcadamente con los enfoques CRISPR-Cas9, que se enfrentan a bajas eficiencias de inserción en células CHO de relevancia industrial, estimadas en alrededor de 1 en 100.000.

Los enfoques tradicionales de edición génica han presentado limitaciones importantes. La recombinación homóloga es un evento raro en células de mamífero, con una frecuencia aproximada de 1 en 10^6-10^7 células por generación. Las células CHO son particularmente refractarias a la reparación dependiente de homología (homology dependent repair, HDR), lo que hace que este enfoque no sea viable para la ingeniería de CHO. Aunque las nucleasas dirigidas como CRISPR-Cas9, TALENs y ZFNs buscaron abordar estas limitaciones induciendo roturas de doble cadena específicas del sitio en loci genómicos definidos, la unión de extremos no homólogos (non-homologous end joining, NHEJ), la vía de reparación dominante en células de mamífero, liga rápidamente los extremos de ADN rotos, dando lugar a inserciones o deleciones.

Un estudio revisado por pares en Molecular Therapy: Methods & Clinical Development utilizó el mapeo genómico óptico (optical genome mapping, OGM) para evaluar alteraciones genómicas derivadas de múltiples enfoques de edición génica, incluidos transposones, transducción lentiviral e inserción de locus mediante CRISPR-Cas9. El estudio informó que OGM se utilizó como un método imparcial y de todo el genoma para detectar grandes reordenamientos genómicos y variantes estructurales con sensibilidad a fracciones de alelos variantes de hasta el 5% en líneas celulares de células madre pluripotentes inducidas humanas antes y después de la edición génica.

Los investigadores hallaron que los transposones y la transducción lentiviral se asociaron con un alto número de inserciones de transgenes, mientras que CRISPR-Cas9 se asoció con una inserción de transgenes más precisa y limitada en las líneas celulares editadas. Según el estudio, OGM identificó variantes estructurales complejas y crípticas y cambios en el número de copias en células modificadas que no fueron detectados por métodos citogenéticos tradicionales ni por métodos basados en secuenciación, lo que sugiere posibles alteraciones genómicas fuera del objetivo (off target) derivadas de los procesos de edición.

En aplicaciones de mejoramiento vegetal, investigadores de UC Davis y del Innovative Genomics Institute de UC Berkeley demostraron que una versión diseñada de una enzima de «gen saltador» llamada TnpB podía editar el genoma de plantas de tabaco mediante un proceso de un solo paso. El método fue altamente eficiente, y las ediciones génicas resultantes se heredaron en más del 90% de la siguiente generación de plantas, una tasa de heredabilidad que iguala a la de Cas9.

La edición génica tiene un enorme potencial para ayudar a alimentar a la creciente población mundial, pero actualmente es difícil, consume mucho tiempo y solo funciona en algunas especies vegetales. Una gran parte del problema es el tamaño de CRISPR/Cas9: es demasiado grande para ser introducido en células vegetales. Los científicos suelen usar virus para entregar la maquinaria de edición génica a células vegetales y animales porque los virus insertan de forma natural ADN y ARN en las células que infectan. Sin embargo, los virus vegetales tienen una limitación de carga, y CRISPR/Cas9 es demasiado grande para que puedan entregarlo.

TnpB está asociado con transposones o «genes saltadores», secuencias cortas de ADN que pueden moverse entre diferentes partes del genoma mediante un mecanismo similar de «cortar y pegar» al de CRISPR/Cas9. Sin embargo, TnpB tiene solo alrededor de 400 aminoácidos frente a los 1300 aminoácidos de Cas9, un tamaño mucho más manejable para la entrega viral.

Se ha demostrado que TnpB bacteriano de ocurrencia natural edita genes en células humanas y vegetales, pero solo funciona alrededor del 3-10% de las veces. Para mejorar la eficiencia de edición génica de TnpB, los investigadores probaron dos versiones mejoradas de TnpB (eTnpBc y eTnpBe). Para aumentar la heredabilidad, los investigadores también añadieron una secuencia corta de ARN que ayuda a que el virus se propague hacia la línea germinal de la planta, las células que producen los óvulos y el esperma de la planta.

Los investigadores probaron los TnpB diseñados en plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) y utilizaron el tobacco rattle virus como su sistema de entrega. Para que las ediciones génicas fueran fácilmente detectables, alteraron un gen con un papel visible: la fitoeno desaturasa (Phytoene desaturase, PDS), que participa en la síntesis de pigmentos. Cuando PDS se desactiva, el tejido vegetal se vuelve blanco.

Cuando inyectaron plántulas de tabaco de dos semanas y media de edad con virus que portaban TnpB, aparecieron manchas blancas en las hojas a medida que el virus se propagaba por las plantas. El análisis molecular del equipo confirmó que eTnpBc, que alcanzó una eficiencia de edición génica de hasta el 70%, fue más eficiente que eTnpBe o la versión de ocurrencia natural de TnpB, que indujeron eficiencias de edición del 26% y 12%, respectivamente.

eTnpBc fue un editor génico aún más eficiente cuando el equipo le encargó editar ChlH, un gen que participa en la síntesis de clorofila. eTnpBc logró una eficiencia de edición génica del 90% para ChlH. Para comprobar si las ediciones génicas eran heredables, los investigadores recolectaron y germinaron las semillas de las plantas editadas. Mostraron que las ediciones dirigidas a PDS y CHlH fueron ambas altamente heredables: el 89% de las plántulas cultivadas a partir de plantas con PDS editado con vainas blancas eran completamente blancas.

La creciente complejidad de los biológicos de próxima generación, como los anticuerpos biespecíficos y triespecíficos, los conjugados anticuerpo-fármaco (antibody-drug conjugates, ADCs) y las vacunas, exige nuevas tecnologías habilitadoras para la ingeniería del genoma en CHO. Los esfuerzos recientes en el desarrollo de sistemas de transposasas hiperactivas acoplados a la biología sintética han creado una única herramienta eficiente para inserciones génicas (knock-ins), silenciamiento génico (knock-downs) y para necesidades de bioingeniería compleja.