De nouvelles méthodes d’administration multiplient par 20 l’efficacité des thérapies à ARNm et permettent des gene drives CRISPR chez les bactéries

Des scientifiques ont identifié une stratégie métabolique simple qui améliore de façon spectaculaire l’administration des thérapies à ARNm et des outils d’édition génomique CRISPR, tandis que d’autres équipes de recherche ont mis au point des systèmes d’administration avancés pour l’édition génétique dans les cellules humaines et les populations bactériennes. Selon une étude publiée dans Science Translational Medicine, des chercheurs dirigés par Daniel Zongjie Wang et Shana O. Kelley chez Biohub ont découvert que l’administration conjointe de trois acides aminés courants avec des nanoparticules lipidiques (LNPs) peut augmenter la délivrance d’ARNm jusqu’à 20 fois et faire passer l’efficacité de l’édition génomique CRISPR d’environ 25 % à près de 90 % après un seul traitement.

Les nanoparticules lipidiques sont surtout connues comme le système d’administration utilisé dans les vaccins à ARNm contre la COVID-19 administrés à des milliards de personnes dans le monde. Les scientifiques explorent désormais leur potentiel pour transporter de l’ARNm thérapeutique dans les cellules afin de traiter le cancer et les maladies inflammatoires, ainsi que pour délivrer des outils d’édition génétique CRISPR capables de corriger des mutations génétiques délétères. Un défi majeur a freiné les progrès : pour que les thérapies basées sur les LNPs fonctionnent, les particules doivent libérer leur charge utile en fusionnant avec les membranes cellulaires, une étape efficace en laboratoire mais beaucoup moins fiable dans l’organisme humain.

Les acides aminés méthionine, arginine et sérine ont entraîné des améliorations marquées lorsqu’ils ont été ajoutés aux traitements par LNPs. Dans de nombreux types cellulaires, la méthode a augmenté la production de la protéine cible d’un facteur cinq à 20, à la fois dans des expériences cellulaires et chez l’animal. L’effet s’est avéré constant avec plusieurs voies d’administration, notamment intramusculaire, intratrachéale et intraveineuse. L’amélioration ne dépendait pas non plus de la formulation lipidique spécifique ni du type de charge utile d’ARNm administrée.

Cette observation est née de l’examen de l’hypothèse selon laquelle ce sont les cellules elles-mêmes qui pourraient limiter le processus, plutôt que les nanoparticules. Lorsque les chercheurs ont cultivé des cellules dans un milieu spécial de type plasma humain, qui reproduit étroitement l’environnement métabolique de l’organisme, l’absorption des LNPs a chuté fortement, diminuant de 50 à 80 %. Les cellules cultivées dans cet environnement de type plasma présentaient une activité réduite dans plusieurs voies métaboliques liées aux acides aminés. Les chercheurs ont conclu que, dans l’organisme, les cellules fonctionnent dans des conditions métaboliques plus « austères », ce qui réduit leur capacité à internaliser des nanoparticules.

Dans une expérience, les chercheurs ont utilisé un modèle murin d’insuffisance hépatique aiguë induite par l’acétaminophène. D’autres expériences ont montré que le mélange d’acides aminés active une voie spécifique d’absorption cellulaire, facilitant l’entrée des nanoparticules dans les cellules.

Par ailleurs, les particules pseudo-virales modifiées (eVLPs) sont apparues comme une plateforme d’administration distincte, qui encapsule des complexes protéiques CRISPR-Cas préassemblés avec un ARN guide et les libère directement dans le cytoplasme via une fusion membranaire inspirée des virus. Cette approche contourne le trafic endosomal et évite une expression prolongée de nucléase dans les cellules receveuses, ce qui se traduit par une fenêtre d’édition plus transitoire.

Sur le plan structural, les eVLPs sont des particules à l’échelle nanométrique mesurant 100–200 nm de diamètre. Elles s’assemblent autour de la polyprotéine rétrovirale Gag, qui forme un cœur capsidique interne entouré d’une enveloppe lipidique dérivée de la membrane de la cellule productrice. La production a généralement lieu dans des cellules HEK293T via une co-transfection transitoire avec des plasmides codant Gag, une fusion Gag–éditeur, l’ARN guide et une glycoprotéine d’enveloppe. La glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G) est couramment utilisée pour conférer un tropisme large, tandis que des alternatives telles que l’enveloppe rétrovirale de babouin (BaEV) peuvent réorienter le ciblage vers des cellules hématopoïétiques.

La plateforme eVLP essentielle pour l’administration de CRISPR-Cas, appelée Nanoblades, a été décrite pour la première fois par Mangeot et al. en 2019 en utilisant la protéine Gag du Moloney murine leukaemia virus (MMLV) fusionnée à la Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9). Elle a démontré une édition dans des cellules primaires et dans des embryons de souris in vivo. Le développement ultérieur s’est concentré sur l’élimination systématique des goulets d’étranglement via des versions successives de particules eVLP d’éditeurs de bases (BE-eVLP).

À partir de la v4, une seule injection intraveineuse a permis d’obtenir 63 % d’édition du gène Pcsk9 dans le foie de souris, entraînant une réduction durable de 78 % des taux circulants de protéine PCSK9. Dans le système nerveux central, une administration locale a produit jusqu’à 60 % d’édition dans les cellules transduites, tandis qu’une injection sous-rétinienne a corrigé la mutation pathogène Rpe65 dans le modèle de dégénérescence rétinienne rd12 avec des efficacités allant jusqu’à 30 %, suffisantes pour restaurer partiellement la fonction visuelle.

Le passage aux BE-eVLP v5 a marqué un basculement de l’ingénierie rationnelle vers l’évolution dirigée fondée sur des bibliothèques. Parce que les eVLPs ne contiennent pas de génome viral, elles n’établissent pas naturellement un lien génotype–phénotype comme le font les criblages de capsides AAV. Chaque mutant de capside Gag a été étiqueté avec un code-barres unique intégré dans le sgRNA co-encapsidé. Le criblage a identifié deux substitutions coopératives, Q226P et C507V, qui ont remodelé l’intérieur de la capside afin de mieux accueillir de grandes charges utiles de type RNP. Ensemble, elles ont permis une augmentation de la puissance d’édition d’un facteur deux à quatre par rapport à la v4.

Le prime editing a introduit une complexité supplémentaire. La protéine de fusion prime editor–transcriptase inverse est nettement plus volumineuse que les éditeurs de bases, et l’ARN guide de prime editing (pegRNA) contient une longue extension en 3′ particulièrement vulnérable à la dégradation. Dans la v3b PE-eVLP, la fusion directe Gag–PE a été remplacée par une protéine échafaudage plus petite recrutée via une interaction en coiled-coil afin d’améliorer le chargement de la charge utile. Le système d’aptamères MS2/MCP a été remplacé par la paire COM/Com à plus forte affinité pour stabiliser la capture du pegRNA. In vivo, une seule injection sous-rétinienne a corrigé environ 15 % de la mutation pathogène Mfrp dans le modèle rd6.

Dans une autre application de la technologie CRISPR, des chercheurs de l’University of California San Diego ont mis au point un système de gene drive pour lutter contre la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. La résistance aux antibiotiques s’est rapidement aggravée ces dernières années, devenant une grave urgence sanitaire mondiale, et des projections suggèrent que d’ici 2050 les superbactéries résistantes aux médicaments pourraient être responsables de plus de 10 millions de décès par an dans le monde.

Les professeurs Ethan Bier et Justin Meyer de la UC San Diego School of Biological Sciences ont créé une deuxième génération du système Pro-Active Genetics (Pro-AG) appelée pPro-MobV. Cette technologie mise à jour est conçue pour se propager dans les communautés bactériennes et désactiver les gènes qui les rendent résistantes aux antibiotiques. Selon des résultats publiés dans la revue Nature npj Antimicrobials and Resistance, les chercheurs ont montré que le système peut circuler via un canal d’accouplement naturel formé entre bactéries, répartissant dans les populations les éléments qui neutralisent la résistance.

Les bases de ces travaux remontent à 2019, lorsque le laboratoire de Bier s’est associé à l’équipe du professeur Victor Nizet de la UC San Diego School of Medicine pour concevoir le système Pro-AG original. Cette première version introduisait une cassette génétique dans les bactéries, lui permettant de se copier entre les génomes bactériens et d’inactiver les gènes de résistance aux antibiotiques. Cette cassette cible spécifiquement des gènes de résistance portés par des plasmides, de petites molécules d’ADN circulaires qui se répliquent dans les cellules bactériennes. En s’insérant dans ces plasmides, la cassette perturbe les gènes de résistance et rend les bactéries de nouveau sensibles aux antibiotiques.

Le nouveau système pPro-MobV étend ce concept en utilisant le transfert conjugal, un processus comparable à l’accouplement bactérien, pour déplacer les composants CRISPR d’une cellule à l’autre. L’équipe a montré que cette méthode fonctionne au sein des biofilms, des communautés microbiennes denses qui adhèrent aux surfaces et sont notoirement difficiles à éliminer avec les méthodes de nettoyage standard. Ils interviennent dans la plupart des infections graves et aident les bactéries à survivre au traitement antibiotique en formant une barrière protectrice qui limite la pénétration des médicaments.

Les chercheurs ont également découvert que des éléments de leur système génétique actif peuvent être transportés par des bactériophages, ou phages, des virus qui infectent naturellement les bactéries. Les phages sont déjà modifiés par ingénierie pour lutter contre la résistance aux antibiotiques en contournant les défenses bactériennes et en délivrant dans les cellules du matériel génétique perturbateur. Ces bactéries dangereuses prospèrent souvent dans les hôpitaux, les stations d’épuration des eaux usées, les élevages et les fermes aquacoles.