新たな送達手法がmRNA治療を20倍に増強し、細菌でCRISPR遺伝子ドライブを実現

科学者らは、mRNA治療やCRISPR遺伝子編集ツールの送達を劇的に改善する単純な代謝戦略を同定した一方、別の研究チームはヒト細胞と細菌集団の双方における遺伝子編集のための高度な送達システムを開発した。Science Translational Medicineに掲載された研究によれば、BiohubのDaniel Zongjie WangとShana O. Kelleyが率いる研究チームは、脂質ナノ粒子（LNPs）とともに一般的なアミノ酸3種を投与すると、mRNA送達が最大20倍増加し、単回治療後のCRISPR遺伝子編集効率が約25%からほぼ90%へ上昇し得ることを見いだした。

脂質ナノ粒子は、世界中で数十億人に接種されたCOVID-19 mRNAワクチンで用いられた送達システムとして最もよく知られている。科学者らは現在、がんや炎症性疾患の治療のために治療用mRNAを細胞内へ運ぶ用途、ならびに有害な遺伝子変異を修復し得るCRISPR遺伝子編集ツールを送達する用途としての可能性を探っている。進展を遅らせてきた大きな課題がある。LNP治療が機能するには、粒子が細胞膜と融合して積荷を放出しなければならないが、この段階は実験室での実験では効率的に起こる一方、ヒト体内でははるかに再現性が低い。

アミノ酸のmethionine、arginine、serineは、LNP治療に併用すると劇的な改善をもたらした。多様な細胞種にわたり、本手法は細胞実験と生体動物の両方で標的タンパク質産生を5～20倍に増加させた。この効果は、筋肉内投与、気管内投与、静脈内投与を含む複数の送達法で一貫していた。また、改善は特定の脂質製剤や、送達されるmRNA積荷の種類に依存しなかった。

この発見は、ナノ粒子ではなく細胞側がプロセスを制限している可能性を検討したことから生まれた。研究者らが、体内の代謝環境を密接に模倣する特殊なヒト血漿様培地で細胞を培養すると、LNP取り込みは急激に低下し、50～80%減少した。血漿様環境で育てた細胞では、アミノ酸に関連する複数の代謝経路の活性が低下していた。研究者らは、体内の細胞はより乏しい代謝条件下で機能しており、そのためナノ粒子を取り込む能力が低下すると結論づけた。

ある実験では、研究者らはacetaminophen誘発性急性肝不全のマウスモデルを用いた。追加の実験により、アミノ酸混合物が特定の細胞取り込み経路を活性化し、ナノ粒子が細胞へ入りやすくなることが示された。

別の研究では、工学的ウイルス様粒子（eVLPs）が、ガイドRNAとともに事前に組み立てたCRISPR-Casタンパク質複合体をパッケージ化し、ウイルスに着想を得た膜融合を介して細胞質へ直接放出する、異なる送達プラットフォームとして台頭している。このアプローチはエンドソーム輸送を回避し、受容細胞内でのヌクレアーゼの持続的発現を避けるため、編集可能な時間窓はより一過性となる。

構造的に、eVLPsは直径100～200 nmのナノスケール粒子である。レトロウイルスのGagポリタンパク質の周囲に組み立てられ、産生細胞膜に由来する脂質エンベロープに包まれた内側のカプシドコアを形成する。産生は通常、Gag、Gag–editor融合体、ガイドRNA、ならびにエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドの一過性共トランスフェクションによりHEK293T細胞で行われる。広い指向性を付与するためにvesicular stomatitis virus glycoprotein（VSV-G）が一般に用いられる一方、baboon retroviral envelope（BaEV）などの代替は造血系細胞へ標的を振り向け得る。

CRISPR-Cas送達のための必須eVLPプラットフォームであるNanobladesは、2019年にMangeotらが、Moloney murine leukaemia virus（MMLV）のGagをStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）に融合した構成で初めて記載した。一次細胞およびマウス胚におけるin vivo編集を示した。その後の開発は、連続するbase editor eVLP（BE-eVLP）バージョンを通じてボトルネックを系統的に除去することに焦点が当てられた。

v4では、単回の静脈内投与によりマウス肝臓でPcsk9遺伝子の63%編集が達成され、循環PCSK9タンパク質レベルは持続的に78%低下した。中枢神経系では、局所投与により導入細胞で最大60%の編集が得られ、網膜下投与ではrd12網膜変性モデルにおける病原性Rpe65変異が最大30%の効率で修復され、部分的な視機能回復に十分であった。

v5 BE-eVLPsへの移行は、合理的設計からライブラリに基づく指向性進化への転換を意味した。eVLPsはウイルスゲノムを欠くため、AAVカプシドスクリーニングのように遺伝子型と表現型を自然に連結しない。各Gagカプシド変異体には、共パッケージ化されるsgRNA内に埋め込まれた固有バーコードが付与された。スクリーニングにより、Q226PとC507Vという2つの協調的置換が同定され、これらがカプシド内部を改変して大型RNP積荷をより収容しやすくすることが示された。両者により、v4に比べて編集力が2～4倍向上した。

Prime editingはさらなる複雑性を導入した。prime editor–reverse transcriptase融合タンパク質はbase editorより大幅に大きく、prime editing guide RNA（pegRNA）は長い3′延長を含み、分解に特に脆弱である。v3b PE-eVLPでは、積荷搭載を改善するため、直接のGag–PE融合は、コイルドコイル相互作用でリクルートされるより小型の足場タンパク質に置換された。pegRNA捕捉の安定化のため、MS2/MCPアプタマー系はより高親和性のCOM/Comペアに置換された。in vivoでは、単回の網膜下投与により、rd6モデルにおける病原性Mfrp変異の約15%が修復された。

CRISPR技術の別の応用として、University of California San Diegoの研究者らは、細菌における抗菌薬耐性に対抗するための遺伝子ドライブシステムを開発した。抗菌薬耐性は近年急速に増大し、深刻な世界的保健上の緊急事態へと拡大している。予測では、2050年までに薬剤耐性の「スーパー耐性菌」により、世界で毎年1,000万人超が死亡する可能性があるとされる。

UC San Diego School of Biological SciencesのEthan Bier教授とJustin Meyer教授は、第2世代のPro-Active Genetics（Pro-AG）システムであるpPro-MobVを作製した。この更新技術は、細菌コミュニティ内に広がり、抗菌薬に耐性を与える遺伝子を無効化するよう設計されている。Nature誌のnpj Antimicrobials and Resistanceに掲載された所見によれば、研究者らは、このシステムが細菌間に形成される自然な接合チャネルを通って移動し、耐性無効化要素を集団全体へ分配できることを示した。

この研究の基盤は2019年に始まった。Bierの研究室はUC San Diego School of MedicineのVictor Nizet教授のチームと提携し、元のPro-AGシステムを設計した。初期バージョンでは、遺伝子カセットを細菌へ導入し、細菌ゲノム間で自己複製しながら抗菌薬耐性遺伝子を停止できるようにした。このカセットは、細菌細胞内で複製される小型の環状DNA分子であるプラスミド上に担持された耐性遺伝子を特異的に標的とする。これらプラスミドに自己挿入することで、カセットは耐性遺伝子を破壊し、細菌を再び抗菌薬に脆弱にする。

新しいpPro-MobVシステムは、細菌の「交配」に似た過程である接合伝達（conjugal transfer）を用いて、CRISPR構成要素をある細胞から別の細胞へ移動させることで、この概念を拡張する。研究チームは、この方法がバイオフィルム内部でも機能することを示した。バイオフィルムは表面に付着する高密度の微生物コミュニティであり、標準的な清掃法では除去が非常に難しいことで知られる。重篤な感染症の大半に関与し、薬剤がどれほど容易に浸透できるかを制限する保護バリアを形成することで、抗菌薬治療を細菌が生き延びるのを助ける。

研究者らはまた、能動的遺伝子システムの要素が、細菌に自然感染するウイルスであるbacteriophage（phage）によって運ばれ得ることを見いだした。phageはすでに、細菌の防御をすり抜けて破壊的な遺伝物質を細胞内へ送り込むことで抗菌薬耐性と闘うよう工学的に改変されつつある。こうした危険な細菌は、病院、下水処理施設、畜産事業、養殖場でしばしば繁殖する。