트랜스포사아제 유전자 편집, 바이오제조와 식물 육종에서 높은 효율 입증

트랜스포사아제 기반 유전자 편집 시스템이 바이오의약품 제조와 식물 육종 응용 모두에서 CRISPR-Cas9 대비 뚜렷한 이점을 보인다는 최근 연구 및 산업계 동향이 나왔다. 이 기술은 노벨상 수상자 Barbara McClintock이 발견한 ‘점핑 유전자(jumping genes)’에 기반하며, 기존 유전자 편집 접근의 핵심 한계를 보완하고 있다.

바이오의약품 제조 분야에서는 Leap-In Transposase와 piggyBac transposase 같은 트랜스포존 시스템이 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포 공정에 채택되고 있다. CHO 세포는 1980년대부터 바이오의약품 생산의 주요 포유류 숙주로 사용돼 왔다. 최초의 CHO 유래 제품은 1987년 FDA 승인을 받았다. 트랜스포사아제는 표적 뉴클레이스(targeted nuclease) 대비 두 가지 핵심 장점을 제공한다. CHO 유전체 전반에 걸친 다중 복제본 통합과 높은 전이(transposition) 효율로, 생산성이 높은 균질(homogeneous) 세포 집단을 만들 수 있다.

트랜스포사아제 효소는 일반적으로 짧은 표적 서열(예: TTAA)과 개방된 크로마틴(open chromatin) 영역만 필요로 하며, 그 결과 CHO 유전체당 2~50개의 통합 복제본이 형성될 수 있다. 전이된 DNA의 무결성(integrity)은 각 통합 부위에서 안정적으로 유지된다. 이는 산업적으로 관련성이 높은 CHO 세포에서 삽입 효율이 낮은 CRISPR-Cas9 접근법과 뚜렷이 대비된다. CRISPR-Cas9의 CHO 세포 삽입 효율은 약 100,000분의 1로 추정된다.

기존 유전자 편집 접근은 상당한 제한을 겪어 왔다. 상동 재조합(homologous recombination)은 포유류 세포에서 드문 사건으로, 세대당 약 10^6~10^7개 세포 중 1개 빈도로 발생한다. CHO 세포는 상동성 의존 수선(homology dependent repair, HDR)에 특히 저항성이 높아, 이 접근은 CHO 엔지니어링에 적합하지 않다. CRISPR-Cas9, TALENs, ZFNs 같은 표적 뉴클레이스는 정의된 유전체 좌위에서 부위특이적 이중가닥 절단(double-strand break)을 유도해 이러한 한계를 해결하려 했지만, 포유류 세포의 우세한 수선 경로인 비상동 말단 연결(non-homologous end joining, NHEJ)이 절단된 DNA 말단을 빠르게 연결하면서 삽입 또는 결실이 발생한다.

Molecular Therapy: Methods & Clinical Development에 게재된 동료심사(peer-reviewed) 연구는 트랜스포존, 렌티바이러스 전달(lentiviral transduction), CRISPR-Cas9 좌위 삽입(locus insertion) 등 여러 유전자 편집 접근에 따른 유전체 변화를 평가하기 위해 광학 유전체 지도화(optical genome mapping, OGM)를 사용했다. 연구는 OGM을 전 유전체 수준의 편향 없는(genome-wide, unbiased) 방법으로 활용해 대규모 유전체 재배열과 구조 변이(structural variant)를 탐지했으며, 유전자 편집 전후의 인간 유도만능줄기세포(human induced pluripotent stem cell) 계통에서 변이 대립유전자 비율(variant allele fraction)이 5%에 불과한 경우에도 민감하게 검출할 수 있었다고 보고했다.

연구진은 트랜스포존과 렌티바이러스 전달이 많은 수의 트랜스진(transgene) 삽입과 연관된 반면, CRISPR-Cas9은 편집된 세포주에서 더 정밀하고 제한적인 트랜스진 삽입과 연관됐다고 밝혔다. 또한 연구에 따르면 OGM은 기존의 세포유전학(cytogenetic) 및 시퀀싱 기반 방법으로는 검출되지 않았던, 엔지니어링된 세포 내 복잡하고 잠재적(cryptic)인 구조 변이와 복제수 변화(copy number change)를 확인했다. 이는 편집 과정에서 오프타깃(off target) 유전체 변화가 발생할 가능성을 시사한다.

식물 육종 응용에서는 UC Davis와 UC Berkeley의 Innovative Genomics Institute 연구진이 TnpB라는 ‘점핑 유전자’ 효소의 공학적 변형체(engineered version)가 단일 단계(one-step) 과정으로 담배 식물 유전체를 편집할 수 있음을 입증했다. 이 방법은 효율이 높았고, 그 결과 유전자 편집은 다음 세대 식물의 90% 이상에서 유전됐다. 이러한 유전성(heredity) 비율은 Cas9과 유사한 수준이다.

유전자 편집은 증가하는 세계 인구를 먹여 살리는 데 막대한 잠재력이 있지만, 현재는 어렵고 시간이 많이 들며 일부 식물 종에서만 작동한다. 문제의 큰 부분은 CRISPR/Cas9의 크기다. 이는 식물 세포 안으로 전달하기에는 너무 크다. 과학자들은 바이러스가 감염한 세포에 DNA와 RNA를 자연스럽게 삽입한다는 점을 활용해 유전자 편집 장치를 식물과 동물 세포에 전달하는 데 바이러스를 자주 사용한다. 그러나 식물 바이러스는 적재(cargo) 한계가 있으며, CRISPR/Cas9은 전달하기에 너무 크다.

TnpB는 트랜스포존 또는 ‘점핑 유전자’와 연관돼 있으며, 이는 CRISPR/Cas9과 유사한 ‘절단-붙여넣기(cut and paste)’ 메커니즘으로 유전체의 서로 다른 부위 사이를 이동할 수 있는 짧은 DNA 서열이다. 그러나 TnpB는 Cas9의 1300 아미노산에 비해 약 400 아미노산 수준에 불과해 바이러스 전달에 훨씬 다루기 쉬운 크기다.

자연적으로 존재하는 세균 유래 TnpB는 인간 및 식물 세포에서 유전자를 편집할 수 있음이 보여졌지만, 작동률은 약 3~10%에 불과하다. TnpB의 유전자 편집 효율을 개선하기 위해 연구진은 강화된 두 가지 버전의 TnpB(eTnpBc, eTnpBe)를 시험했다. 유전성을 높이기 위해 연구진은 바이러스가 식물의 생식계열(germline)—식물의 난자와 정자를 만드는 세포—로 확산하는 데 도움을 주는 짧은 RNA 서열도 추가했다.

연구진은 담배(Nicotiana benthamiana)에서 공학적 TnpB를 시험했고, 전달 시스템으로 tobacco rattle virus를 사용했다. 유전자 편집을 쉽게 확인하기 위해 눈에 보이는 역할을 하는 유전자인 Phytoene desaturase (PDS)를 교란했다. PDS는 색소 합성에 관여하며, PDS가 꺼지면 식물 조직이 흰색으로 변한다.

생후 2주 반 된 담배 유묘에 TnpB를 탑재한 바이러스를 주입하자, 바이러스가 식물 전체로 퍼지면서 잎에 흰 반점이 나타났다. 연구팀의 분자 분석은 유전자 편집 효율이 최대 70%에 이른 eTnpBc가 eTnpBe 또는 자연형 TnpB보다 효율이 높음을 확인했다. eTnpBe와 자연형 TnpB의 편집 효율은 각각 26%와 12%를 유도했다.

eTnpBc는 엽록소 합성에 관여하는 유전자인 ChlH를 편집하도록 했을 때 더 효율적인 유전자 편집기로 작동했다. eTnpBc는 ChlH에 대해 90%의 유전자 편집 효율을 달성했다. 유전자 편집이 유전되는지 확인하기 위해 연구진은 편집된 식물의 종자를 채집해 발아시켰다. 그 결과 PDS와 CHlH를 표적으로 한 유전자 편집 모두 유전성이 높았다. 흰 꼬투리(white pods)를 보인 PDS 편집 식물에서 얻은 유묘의 89%는 완전히 흰색이었다.

이중·삼중 특이 항체(bi- and trispecific antibodies), 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugates, ADCs), 백신 등 차세대 바이오의약품의 복잡성이 증가함에 따라 CHO 유전체 엔지니어링을 가능하게 하는 새로운 기반 기술이 요구된다. 최근 초활성(hyperactive) 트랜스포사아제 시스템 개발과 합성생물학(synthetic biology)의 결합 노력은 유전자 삽입(knock-ins), 발현 저하(knock-downs), 그리고 복잡한 바이오엔지니어링 요구를 위한 단일의 효율적 도구를 만들어 내고 있다.