トランスポザーゼ遺伝子編集、バイオ製造と植物育種で高効率を示す
トランスポザーゼを用いる遺伝子編集システムが、バイオ医薬品製造と植物育種においてCRISPR-Cas9の有力な代替として台頭している。CHO細胞では高効率な多コピー統合が示され、植物では改変TnpBが最大90%の編集効率と高い遺伝性を達成し、サイズ面でも送達に有利だと報告された。
内容： 近年の研究および業界動向によれば、トランスポザーゼに基づく遺伝子編集システムは、バイオ医薬品製造と植物育種の双方でCRISPR-Cas9に対する重要な優位性を示している。この技術は、ノーベル賞受賞者Barbara McClintockが発見した「跳ぶ遺伝子」を基盤としており、従来の遺伝子編集手法の主要な制約に対処しつつある。
バイオ医薬品製造では、Leap-In TransposaseやpiggyBac transposaseなどのトランスポゾン系が、Chinese Hamster Ovary（CHO）細胞のエンジニアリングに採用されている。CHO細胞は1980年代以降、バイオ医薬品生産における主要な哺乳類宿主として用いられてきた。最初のCHO由来製品は1987年にFDAの承認を受けた。トランスポザーゼは標的ヌクレアーゼに比べ、CHOゲノム全体にわたる多コピー統合と高いトランスポジション効率という2つの重要な利点を提供し、その結果、高生産性で均一な細胞集団を得られる。
トランスポザーゼ酵素は通常、短い標的配列（例：TTAA）とオープンクロマチン領域のみを必要とし、CHOゲノムあたり2〜50コピーの統合が生じ得る。転移したDNAの完全性は、各統合部位で安定的に維持される。これは、産業的に重要なCHO細胞での挿入効率が低く、約10万分の1と推定されるCRISPR-Cas9アプローチとは対照的である。
従来の遺伝子編集アプローチには大きな限界があった。相同組換えは哺乳類細胞ではまれな事象であり、世代あたり約10^6〜10^7細胞に1回程度の頻度で起こる。CHO細胞は相同組換え依存修復（HDR）に特に抵抗性があり、このアプローチはCHOエンジニアリングには実用的ではない。CRISPR-Cas9、TALENs、ZFNsなどの標的ヌクレアーゼは、定義されたゲノム座位で部位特異的な二本鎖切断を誘導することでこの制約の克服を目指したが、哺乳類細胞で優勢な修復経路である非相同末端結合（NHEJ）が切断されたDNA末端を速やかに連結し、挿入や欠失が生じる。
Molecular Therapy: Methods & Clinical Developmentに掲載された査読付き研究では、トランスポゾン、レンチウイルスによるトランスダクション、CRISPR-Cas9による座位挿入など、複数の遺伝子編集アプローチによるゲノム変化を評価するため、光学的ゲノムマッピング（OGM）が用いられた。同研究は、OGMがゲノム全体を対象としたバイアスのない手法として、大規模なゲノム再編成や構造多型を検出でき、遺伝子編集前後のヒト人工多能性幹細胞株において、5%という低いバリアントアリル分画に対しても感度を有すると報告した。
研究者らは、トランスポゾンとレンチウイルスによるトランスダクションが多数のトランスジーン挿入と関連する一方、CRISPR-Cas9は編集細胞株においてより精密で限定的なトランスジーン挿入と関連していたことを見いだした。研究によれば、OGMは、従来の細胞遺伝学的手法やシーケンシングに基づく手法では検出されなかった、エンジニアリング細胞における複雑かつ潜在的な構造多型およびコピー数変化を同定し、編集プロセスに起因する潜在的なオフターゲットのゲノム変化を示唆した。
植物育種の応用では、UC DavisおよびUC BerkeleyのInnovative Genomics Instituteの研究者らが、TnpBと呼ばれる「跳ぶ遺伝子」酵素の改変版が、ワンステップのプロセスでタバコ植物のゲノムを編集できることを実証した。この手法は高効率であり、得られた遺伝子編集は次世代植物の90%以上に継承された—Cas9のそれに匹敵する遺伝率である。
遺伝子編集は増加する世界人口の食料供給に貢献し得る大きな可能性を持つが、現時点では難易度が高く、時間がかかり、一部の植物種でしか機能しない。問題の大きな要因の一つはCRISPR/Cas9のサイズであり、植物細胞へ送達するには大きすぎる。科学者は、ウイルスが感染した細胞へDNAやRNAを自然に挿入する性質を利用して、植物や動物細胞に遺伝子編集機構を送達することが多い。しかし、植物ウイルスには搭載量の制約があり、CRISPR/Cas9はそれらが送達するには大きすぎる。
TnpBはトランスポゾン、すなわち「跳ぶ遺伝子」と関連しており、これはCRISPR/Cas9に似た「切り貼り」機構を用いてゲノム内の異なる領域間を移動できる短いDNA配列である。しかし、TnpBはCas9の1300アミノ酸に対し約400アミノ酸しかなく、ウイルス送達にとってははるかに扱いやすいサイズである。
自然界に存在する細菌由来TnpBは、ヒト細胞および植物細胞で遺伝子を編集できることが示されているが、成功率は3〜10%程度にとどまる。TnpBの遺伝子編集効率を改善するため、研究者らは強化型TnpBの2種類（eTnpBcおよびeTnpBe）を検討した。さらに遺伝率を高めるため、ウイルスが植物の生殖系列（配偶子となる卵・精子を作る細胞）へ広がるのを助ける短いRNA配列も追加した。
研究者らは、改変TnpBをタバコ（Nicotiana benthamiana）で評価し、送達系としてtobacco rattle virusを用いた。遺伝子編集を容易に検出できるよう、目に見える役割を持つ遺伝子—色素合成に関与するPhytoene desaturase（PDS）—を破壊した。PDSがオフになると、植物組織は白化する。
生後2週間半のタバコ苗にTnpBを搭載したウイルスを注入すると、ウイルスが植物体内に広がるにつれて葉に白斑が現れた。チームの分子解析により、遺伝子編集効率が最大70%に達したeTnpBcは、eTnpBeまたは自然型TnpBよりも効率的であり、それぞれの編集効率は26%および12%であったことが確認された。
eTnpBcは、クロロフィル合成に関与する遺伝子であるChlHの編集を担わせた場合、さらに効率的な遺伝子エディターとなった。eTnpBcはChlHに対して90%の遺伝子編集効率を達成した。遺伝子編集が継承されるかどうかを検証するため、研究者らは遺伝子編集植物の種子を回収して発芽させた。その結果、PDSおよびCHlHを標的とした遺伝子編集はいずれも高い遺伝性を示し、白い莢を持つPDS編集植物から得た実生の89%が完全に白化していた。
二重特異性・三重特異性抗体、抗体薬物複合体（ADCs）、ワクチンなどの次世代バイオ医薬品は複雑性が増しており、CHOゲノムエンジニアリングのための新規で実現可能な技術が求められている。合成生物学と組み合わせた高活性トランスポザーゼシステムの開発に向けた近年の取り組みにより、遺伝子ノックイン、ノックダウン、ならびに複雑なバイオエンジニアリング要件に対応する単一の効率的ツールが創出されつつある。