Edição gênica com transposases mostra alta eficiência na biomanufatura e no melhoramento de plantas

Sistemas de edição gênica baseados em transposases vêm demonstrando vantagens relevantes em relação ao CRISPR-Cas9 tanto na manufatura biofarmacêutica quanto em aplicações de melhoramento de plantas, segundo pesquisas recentes e desenvolvimentos da indústria. A tecnologia, baseada em “genes saltadores” descobertos pela ganhadora do Nobel Barbara McClintock, aborda limitações centrais das abordagens tradicionais de edição genética.

Na manufatura biofarmacêutica, sistemas de transposons como Leap-In Transposase e piggyBac transposase vêm sendo adotados para engenharia de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), que servem como principal hospedeiro mamífero para produção biofarmacêutica desde a década de 1980. O primeiro produto derivado de CHO foi aprovado pela FDA em 1987. As transposases oferecem duas vantagens críticas em relação às nucleases direcionadas: integrações multicópias ao longo do genoma de CHO e alta eficiência de transposição, resultando em populações celulares homogêneas altamente produtivas.

A enzima transposase normalmente requer apenas uma sequência-alvo curta (por exemplo, TTAA) e uma região de cromatina aberta, resultando em algo entre 2 e 50 cópias de integração por genoma de CHO. A integridade do DNA transposto é mantida de forma estável em cada sítio de integração. Isso contrasta fortemente com abordagens com CRISPR-Cas9, que enfrentam baixas eficiências de inserção em células de CHO relevantes do ponto de vista industrial, estimadas em torno de 1 em 100.000.

Abordagens tradicionais de edição gênica enfrentam limitações significativas. A recombinação homóloga é um evento raro em células de mamíferos, ocorrendo com frequência de aproximadamente 1 em 106–107 células por geração. As células de CHO são particularmente refratárias ao reparo dependente de homologia (HDR), tornando essa abordagem inviável para engenharia de CHO. Embora nucleases direcionadas como CRISPR-Cas9, TALENs e ZFNs tenham buscado contornar essas limitações induzindo quebras de dupla fita específicas em loci genômicos definidos, a junção de extremidades não homólogas (NHEJ), a via de reparo dominante em células de mamíferos, liga rapidamente as extremidades de DNA quebradas, resultando em inserções ou deleções.

Um estudo revisado por pares na Molecular Therapy: Methods & Clinical Development usou mapeamento genômico óptico (OGM) para avaliar alterações genômicas decorrentes de múltiplas abordagens de edição gênica, incluindo transposons, transdução lentiviral e inserção de locus por CRISPR-Cas9. O estudo relatou que o OGM foi utilizado como um método não enviesado, em todo o genoma, para detectar grandes rearranjos genômicos e variantes estruturais, com sensibilidade a frações alélicas variantes tão baixas quanto 5% em linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas humanas antes e após a edição gênica.

Os pesquisadores observaram que transposons e transdução lentiviral estavam associados a um alto número de inserções de transgene, enquanto CRISPR-Cas9 esteve associado a inserções de transgene mais precisas e limitadas nas linhagens celulares editadas. Segundo o estudo, o OGM identificou variantes estruturais complexas e crípticas e alterações no número de cópias em células engenheiradas que não foram detectadas por métodos citogenéticos tradicionais e baseados em sequenciamento, sugerindo potenciais alterações genômicas fora do alvo decorrentes dos processos de edição.

Em aplicações de melhoramento de plantas, pesquisadores da UC Davis e do Innovative Genomics Institute da UC Berkeley demonstraram que uma versão engenheirada de uma enzima de “gene saltador” chamada TnpB poderia editar o genoma de plantas de tabaco por meio de um processo de etapa única. O método foi altamente eficiente, e as edições gênicas resultantes foram herdadas por mais de 90% da geração seguinte de plantas — uma taxa de herdabilidade que se equipara à do Cas9.

A edição gênica tem enorme potencial para ajudar a alimentar a população mundial em crescimento, mas atualmente é difícil, demorada e só funciona em algumas espécies vegetais. Uma parte importante do problema é o tamanho do CRISPR/Cas9: ele é grande demais para ser entregue às células vegetais. Cientistas frequentemente usam vírus para entregar a maquinaria de edição gênica a células vegetais e animais porque vírus inserem naturalmente DNA e RNA nas células que infectam. No entanto, vírus de plantas têm uma limitação de carga, e o CRISPR/Cas9 é grande demais para que eles o entreguem.

O TnpB está associado a transposons ou “genes saltadores”, sequências curtas de DNA que podem se mover entre diferentes partes do genoma usando um mecanismo de “corta e cola” semelhante ao do CRISPR/Cas9. Porém, o TnpB tem apenas cerca de 400 aminoácidos em comparação com os 1300 aminoácidos do Cas9 — um tamanho muito mais manejável para entrega viral.

Foi demonstrado que o TnpB bacteriano de ocorrência natural edita genes em células humanas e vegetais, mas ele só funciona em cerca de 3–10% das vezes. Para melhorar a eficiência de edição gênica do TnpB, os pesquisadores testaram duas versões aprimoradas de TnpB (eTnpBc e eTnpBe). Para aumentar a herdabilidade, os pesquisadores também adicionaram uma sequência curta de RNA que ajuda a disseminação viral até a linhagem germinativa da planta, as células que produzem os óvulos e os espermatozoides da planta.

Os pesquisadores testaram os TnpBs engenheirados em plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) e usaram o tobacco rattle virus como sistema de entrega. Para tornar as edições gênicas facilmente detectáveis, eles interromperam um gene com um papel visível: Phytoene desaturase (PDS), que está envolvido na síntese de pigmentos. Quando o PDS é desligado, o tecido da planta fica branco.

Quando injetaram mudas de tabaco com duas semanas e meia de idade com vírus carregando TnpB, manchas brancas apareceram nas folhas à medida que o vírus se espalhava pelas plantas. A análise molecular da equipe confirmou que o eTnpBc, que alcançou eficiência de edição gênica de até 70%, foi mais eficiente do que o eTnpBe ou a versão de ocorrência natural do TnpB, que induziram eficiências de edição de 26% e 12%, respectivamente.

eTnpBc foi um editor gênico ainda mais eficiente quando a equipe o encarregou de editar ChlH, um gene envolvido na síntese de clorofila. O eTnpBc alcançou 90% de eficiência de edição gênica para ChlH. Para testar se as edições gênicas eram herdáveis, os pesquisadores coletaram e germinaram as sementes das plantas editadas. Eles mostraram que as edições gênicas visando PDS e CHlH foram ambas altamente herdáveis: 89% das plântulas cultivadas a partir de plantas com PDS editado e vagens brancas eram completamente brancas.

A crescente complexidade de biológicos de próxima geração, como anticorpos bi- e triespecíficos, conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) e vacinas, exige tecnologias novas e habilitadoras para a engenharia do genoma de CHO. Esforços recentes no desenvolvimento de sistemas de transposase hiperativos, aliados à biologia sintética, criaram uma única ferramenta eficiente para knock-ins e knock-downs genéticos e para necessidades complexas de bioengenharia.