Transposase-Genomeditierung zeigt hohe Effizienz in Bioproduktion und Pflanzenzüchtung
Transposasebasierte Systeme entwickeln sich zu effizienten Alternativen zu CRISPR-Cas9 für die Genomeditierung in der biopharmazeutischen Herstellung und der Pflanzenzüchtung. Studien berichten von Integrations- und Vererbbarkeitsraten bis zu 90% und verweisen zugleich auf Vorteile bei Größe, Mehrfachintegration und Integrationsfähigkeit.
Transposasebasierte Genomeditierungssysteme zeigen laut jüngsten Forschungsarbeiten und Entwicklungen in der Industrie sowohl in der biopharmazeutischen Herstellung als auch in Anwendungen der Pflanzenzüchtung deutliche Vorteile gegenüber CRISPR-Cas9. Die Technologie, die auf „springenden Genen“ beruht, die von der Nobelpreisträgerin Barbara McClintock entdeckt wurden, adressiert zentrale Einschränkungen traditioneller Genomeditierungsansätze.
In der biopharmazeutischen Herstellung wurden Transposon-Systeme wie Leap-In Transposase und piggyBac transposase für die Engineering-Arbeit an Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen übernommen, die seit den 1980er-Jahren als primärer Säugetier-Wirt für die biopharmazeutische Produktion dienen. Das erste aus CHO-Zellen gewonnene Produkt wurde 1987 von der FDA zugelassen. Transposasen bieten gegenüber zielgerichteten Nukleasen zwei entscheidende Vorteile: Multikopien-Integrationen über das gesamte CHO-Genom hinweg und eine hohe Transpositions-Effizienz, was zu hochproduktiven, homogenen Zellpopulationen führt.
Das Transposase-Enzym benötigt typischerweise nur eine kurze Zielsequenz (z. B. TTAA) und eine Region mit offenem Chromatin, wodurch pro CHO-Genom zwischen 2 und 50 Integrationskopien entstehen können. Die Integrität der transponierten DNA bleibt an jeder Integrationsstelle stabil erhalten. Dies steht in starkem Kontrast zu CRISPR-Cas9-Ansätzen, die in industriell relevanten CHO-Zellen mit niedrigen Insertions-Effizienzen konfrontiert sind, die auf etwa 1 zu 100.000 geschätzt werden.
Traditionelle Genomeditierungsansätze unterlagen erheblichen Limitationen. Homologe Rekombination ist in Säugetierzellen ein seltenes Ereignis und tritt mit einer Frequenz von etwa 1 in 106–107 Zellen pro Generation auf. CHO-Zellen sind insbesondere gegenüber homology dependent repair (HDR) wenig empfänglich, wodurch dieser Ansatz für CHO-Engineering nicht praktikabel ist. Während zielgerichtete Nukleasen wie CRISPR-Cas9, TALENs und ZFNs diese Einschränkungen durch die Induktion ortsspezifischer Doppelstrangbrüche an definierten genomischen Loci adressieren sollten, verknüpft non-homologous end joining (NHEJ) als dominanter Reparaturweg in Säugetierzellen die gebrochenen DNA-Enden rasch wieder, was zu Insertionen oder Deletionen führt.
Eine peer-reviewte Studie in Molecular Therapy: Methods & Clinical Development nutzte optical genome mapping (OGM), um genomische Veränderungen durch mehrere Genomeditierungsansätze zu bewerten, darunter Transposons, lentivirale Transduktion und CRISPR-Cas9-Locus-Insertion. Die Studie berichtete, dass OGM als genomweitiges, unvoreingenommenes Verfahren eingesetzt wurde, um große genomische Umlagerungen und strukturelle Varianten mit einer Sensitivität bis zu Variant Allele Fractions von nur 5% in humanen induzierten pluripotenten Stammzelllinien vor und nach der Genomeditierung zu detektieren.
Die Forschenden fanden, dass Transposons und lentivirale Transduktion mit einer hohen Zahl an Transgen-Insertionen assoziiert waren, während CRISPR-Cas9 in den editierten Zelllinien mit präziseren und begrenzteren Transgen-Insertionen assoziiert war. Laut Studie identifizierte OGM komplexe und kryptische strukturelle Varianten sowie Kopienzahlveränderungen in technisch veränderten Zellen, die mit traditionellen zytogenetischen sowie sequenzierungsbasierten Methoden nicht erkannt worden waren, was auf potenzielle off target-genomische Veränderungen durch Editierungsprozesse hindeutet.
In Anwendungen der Pflanzenzüchtung zeigten Forschende der UC Davis und des Innovative Genomics Institute der UC Berkeley, dass eine gentechnisch veränderte Version eines „springenden Gen“-Enzyms namens TnpB das Genom von Tabakpflanzen in einem einstufigen Prozess editieren kann. Die Methode war hoch effizient, und die resultierenden Gen-Edits wurden in mehr als 90% der nächsten Pflanzengeneration vererbt – eine Vererbbarkeitsrate, die der von Cas9 entspricht.
Die Genomeditierung hat ein enormes Potenzial, die wachsende Weltbevölkerung zu ernähren, ist derzeit jedoch schwierig, zeitaufwendig und funktioniert nur in einigen Pflanzenarten. Ein wesentlicher Teil des Problems ist die Größe von CRISPR/Cas9: Es ist zu groß, um in Pflanzenzellen eingebracht zu werden. Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler nutzen häufig Viren, um Genomeditierungs-Maschinerie in Pflanzen- und Tierzellen zu liefern, da Viren natürlicherweise DNA und RNA in die Zellen einschleusen, die sie infizieren. Pflanzenviren haben jedoch eine begrenzte Ladekapazität, und CRISPR/Cas9 ist für deren Transport zu groß.
TnpB ist mit Transposons bzw. „springenden Genen“ assoziiert – kurzen DNA-Sequenzen, die sich mithilfe eines ähnlichen „Ausschneiden-und-Einfügen“-Mechanismus wie CRISPR/Cas9 zwischen verschiedenen Teilen des Genoms bewegen können. TnpB umfasst jedoch nur etwa 400 Aminosäuren im Vergleich zu den 1300 Aminosäuren von Cas9 – eine deutlich besser handhabbare Größe für die virale Lieferung.
Es wurde gezeigt, dass natürlich vorkommendes bakterielles TnpB Gene in humanen und pflanzlichen Zellen editieren kann, allerdings funktioniert dies nur in etwa 3–10% der Fälle. Um die Genomeditierungs-Effizienz von TnpB zu verbessern, testeten die Forschenden zwei optimierte Versionen von TnpB (eTnpBc und eTnpBe). Um die Vererbbarkeit zu erhöhen, fügten die Forschenden zudem eine kurze RNA-Sequenz hinzu, die die virale Ausbreitung in die Keimbahn der Pflanze unterstützt – jene Zellen, die die Eizellen und Spermien einer Pflanze hervorbringen.
Die Forschenden testeten die konstruierten TnpBs in Tabakpflanzen (Nicotiana benthamiana) und verwendeten tobacco rattle virus als ihr Liefersystem. Um die Gen-Edits leicht nachweisbar zu machen, unterbrachen sie ein Gen mit sichtbarer Funktion: Phytoene desaturase (PDS), das an der Pigmentsynthese beteiligt ist. Wird PDS ausgeschaltet, wird Pflanzengewebe weiß.
Als sie zweieinhalb Wochen alte Tabaksämlinge mit TnpB-tragenden Viren injizierten, erschienen weiße Flecken auf den Blättern, während sich das Virus in den Pflanzen ausbreitete. Die molekulare Analyse des Teams bestätigte, dass eTnpBc, das eine Genomeditierungs-Effizienz von bis zu 70% erreichte, effizienter war als eTnpBe oder die natürlich vorkommende Version von TnpB, die Editierungs-Effizienzen von 26% bzw. 12% induzierten.
eTnpBc war ein noch effizienterer Gen-Editor, als das Team es mit der Editierung von ChlH beauftragte, einem Gen, das an der Chlorophyllsynthese beteiligt ist. eTnpBc erreichte für ChlH eine Genomeditierungs-Effizienz von 90%. Um zu testen, ob die Gen-Edits vererbbar sind, sammelten die Forschenden Samen der gen-editierten Pflanzen und ließen sie keimen. Sie zeigten, dass die Gen-Edits, die auf PDS und CHlH zielten, beide hoch vererbbar waren: 89% der Sämlinge, die aus PDS-editierten Pflanzen mit weißen Schoten gezogen wurden, waren vollständig weiß.
Die zunehmende Komplexität der Biologika der nächsten Generation – wie bi- und trispezifische Antikörper, antibody-drug conjugates (ADCs) und Impfstoffe – erfordert neuartige, ermöglichende Technologien für das CHO-Genom-Engineering. Jüngste Bemühungen in der Entwicklung hyperaktiver Transposase-Systeme in Kombination mit synthetischer Biologie haben ein einzelnes, effizientes Werkzeug für genetische Knock-ins, Knock-downs und für komplexe Bioengineering-Anforderungen geschaffen.