L’édition génétique par transposase affiche une efficacité élevée en bioproduction et en sélection végétale

Les systèmes d’édition génétique basés sur les transposases démontrent des avantages significatifs par rapport à CRISPR-Cas9, tant dans la fabrication biopharmaceutique que dans les applications de sélection végétale, selon des recherches récentes et des développements industriels. Cette technologie, fondée sur les « gènes sauteurs » découverts par la lauréate du prix Nobel Barbara McClintock, s’attaque à des limites clés des approches classiques d’édition du génome.

Dans la fabrication biopharmaceutique, des systèmes de transposons tels que Leap-In Transposase et piggyBac transposase ont été adoptés pour l’ingénierie de cellules d’ovaire de hamster chinois (Chinese Hamster Ovary, CHO), qui servent d’hôte mammifère principal pour la production biopharmaceutique depuis les années 1980. Le premier produit dérivé de cellules CHO a été approuvé par la FDA en 1987. Les transposases offrent deux avantages essentiels par rapport aux nucléases ciblées : des intégrations en multicopies à travers le génome des CHO et une efficacité de transposition élevée, ce qui se traduit par des populations cellulaires homogènes et hautement productives.

L’enzyme transposase ne requiert généralement qu’une courte séquence cible (p. ex., TTAA) et une région de chromatine ouverte, ce qui aboutit à 2 à 50 copies d’intégration par génome de CHO. L’intégrité de l’ADN transposé est maintenue de façon stable à chaque site d’intégration. Cela contraste fortement avec les approches CRISPR-Cas9, qui présentent de faibles efficacités d’insertion dans des cellules CHO pertinentes sur le plan industriel, estimées à environ 1 sur 100000.

Les approches traditionnelles d’édition génétique ont été confrontées à des limitations importantes. La recombinaison homologue est un événement rare dans les cellules de mammifères, avec une fréquence d’environ 1 sur 106-107 cellules par génération. Les cellules CHO sont particulièrement réfractaires à la réparation dirigée par homologie (HDR), rendant cette approche non viable pour l’ingénierie des CHO. Alors que des nucléases ciblées comme CRISPR-Cas9, TALENs et ZFNs ont cherché à lever ces limites en induisant des cassures double brin spécifiques de site à des loci génomiques définis, la jonction d’extrémités non homologues (NHEJ), voie de réparation dominante chez les mammifères, ligature rapidement les extrémités d’ADN rompues, entraînant des insertions ou des délétions.

Une étude évaluée par des pairs, publiée dans Molecular Therapy: Methods & Clinical Development, a utilisé la cartographie optique du génome (optical genome mapping, OGM) pour évaluer les altérations génomiques issues de plusieurs approches d’édition génétique, notamment les transposons, la transduction lentivirale et l’insertion de locus par CRISPR-Cas9. L’étude a rapporté que l’OGM a été utilisée comme méthode non biaisée à l’échelle du génome pour détecter de grands réarrangements génomiques et des variants structuraux, avec une sensibilité à des fractions d’allèles variants aussi faibles que 5% dans des lignées de cellules souches pluripotentes induites humaines, avant et après l’édition génétique.

Les chercheurs ont constaté que les transposons et la transduction lentivirale étaient associés à un nombre élevé d’insertions de transgènes, tandis que CRISPR-Cas9 était associé à une insertion de transgènes plus précise et plus limitée dans les lignées cellulaires éditées. Selon l’étude, l’OGM a identifié des variants structuraux complexes et cryptiques ainsi que des modifications du nombre de copies dans des cellules modifiées, non détectés par les méthodes cytogénétiques traditionnelles et celles fondées sur le séquençage, suggérant des altérations génomiques potentielles hors cible induites par les प्रक्रés d’édition.

Dans des applications de sélection végétale, des chercheurs de UC Davis et de l’Innovative Genomics Institute de UC Berkeley ont montré qu’une version modifiée d’une enzyme de « gène sauteur » appelée TnpB pouvait éditer le génome de plants de tabac via un processus en une étape. La méthode s’est révélée très efficace, et les modifications génétiques obtenues ont été héritées par plus de 90% de la génération suivante de plants — un taux d’héritabilité comparable à celui de Cas9.

L’édition génétique a un potentiel énorme pour aider à nourrir une population mondiale croissante, mais elle reste actuellement difficile, chronophage et ne fonctionne que dans certaines espèces végétales. Une part importante du problème tient à la taille de CRISPR/Cas9 : il est trop volumineux pour être délivré dans les cellules végétales. Les scientifiques utilisent souvent des virus pour acheminer la machinerie d’édition génétique dans des cellules végétales et animales, car les virus insèrent naturellement de l’ADN et de l’ARN dans les cellules qu’ils infectent. Cependant, les virus des plantes ont une limitation de charge utile, et CRISPR/Cas9 est trop grand pour être transporté.

TnpB est associé aux transposons, ou « gènes sauteurs », de courtes séquences d’ADN capables de se déplacer entre différentes régions du génome en utilisant un mécanisme de « couper-coller » similaire à celui de CRISPR/Cas9. Toutefois, TnpB ne compte qu’environ 400 acides aminés, contre 1300 acides aminés pour Cas9 — une taille bien plus gérable pour une délivrance virale.

Il a été montré que le TnpB bactérien naturel pouvait éditer des gènes dans des cellules humaines et végétales, mais il ne fonctionne que dans environ 3 à 10% des cas. Pour améliorer l’efficacité d’édition génétique de TnpB, les chercheurs ont testé deux versions améliorées de TnpB (eTnpBc et eTnpBe). Pour augmenter l’héritabilité, les chercheurs ont également ajouté une courte séquence d’ARN qui favorise la propagation virale vers la lignée germinale de la plante, c’est-à-dire les cellules qui produisent les ovules et le pollen.

Les chercheurs ont testé les TnpB modifiés chez des plants de tabac (Nicotiana benthamiana) et ont utilisé le tobacco rattle virus comme système de délivrance. Pour rendre les modifications génétiques facilement détectables, ils ont perturbé un gène au rôle visible : Phytoene desaturase (PDS), impliqué dans la synthèse des pigments. Lorsque PDS est inactivé, les tissus végétaux blanchissent.

Lorsqu’ils ont injecté des jeunes plants de tabac âgés de deux semaines et demie avec des virus portant TnpB, des taches blanches sont apparues sur les feuilles à mesure que le virus se propageait dans les plants. L’analyse moléculaire de l’équipe a confirmé que eTnpBc, qui a atteint une efficacité d’édition génétique allant jusqu’à 70%, était plus efficace que eTnpBe ou la version naturelle de TnpB, qui induisaient des efficacités d’édition de 26% et 12%, respectivement.

eTnpBc s’est avéré un éditeur génétique encore plus efficace lorsque l’équipe l’a chargé d’éditer ChlH, un gène impliqué dans la synthèse de la chlorophylle. eTnpBc a atteint 90% d’efficacité d’édition génétique pour ChlH. Pour vérifier si les modifications étaient héréditaires, les chercheurs ont récolté et fait germer les graines des plants édités. Ils ont montré que les modifications ciblant PDS et CHlH étaient toutes deux hautement héréditaires : 89% des plantules issues de plants édités sur PDS avec des gousses blanches étaient complètement blanches.

La complexité croissante des produits biologiques de nouvelle génération, tels que les anticorps bispécifiques et trispécifiques, les conjugués anticorps-médicament (ADCs) et les vaccins, exige de nouvelles technologies habilitantes pour l’ingénierie du génome des cellules CHO. Les efforts récents visant à développer des systèmes de transposase hyperactifs couplés à la biologie synthétique ont permis de créer un outil unique et efficace pour les insertions génétiques (knock-ins), les inhibitions d’expression (knock-downs) et des besoins de bioingénierie complexes.