Fortschritte bei der Steuerung von CAR-T-Zellen: Dualer Rezeptor-Knockout und arzneimittelgesteuerte Schalter

Forscher haben mehrere biotechnologische Strategien zur Verbesserung der Wirksamkeit und Sicherheit der CAR-T-Zell-Therapie vorgestellt. Dazu gehören ein dualer Rezeptor-Knockout-Ansatz für solide Tumore sowie arzneimittelgesteuerte Schalter, die eine präzise Regulierung der therapeutischen Aktivität ermöglichen.

In einem bahnbrechenden Fortschritt bei der Behandlung solider Tumoren haben Forscher eine Strategie entwickelt, welche die Potenz der CAR-T-Zell-Therapie durch die präzise genetische Ausschaltung der Prostaglandin-E2 (PGE2)-Signalisierung drastisch erhöht. Dabei wurden die beiden entsprechenden Rezeptoren in den manipulierten Immunzellen selbst ausgeschaltet (Knockout). Während die CAR-T-Zell-Therapie die Behandlung bestimmter Blutkrebserkrankungen revolutioniert hat, stand ihre Anwendung bei soliden Tumoren aufgrund der feindlichen, immunsuppressiven Mikroumgebung, die diese Tumoren schaffen, vor großen Herausforderungen. PGE2, ein bioaktiver Lipidmediator, der im Tumormilieu weit verbreitet ist, spielt eine entscheidende Rolle bei der Dämpfung von Immunreaktionen, indem er an seine Rezeptoren auf Immunzellen bindet und so die Anti-Tumor-Aktivität von CAR-T-Zellen effektiv unterdrückt.

Der duale Rezeptor-Knockout wurde mit modernsten Geneditierungswerkzeugen erstellt, die sowohl die Genauigkeit als auch die Dauerhaftigkeit der Rezeptorausschaltung im Genom der CAR-T-Zellen gewährleisten. Diesem präzisen Geneditierungsansatz folgten strenge funktionelle Assays, um zu bestätigen, dass die modifizierten CAR-T-Zellen nicht nur frei von PGE2-vermittelter Signalisierung waren, sondern auch ihre lebenswichtigen zytotoxischen Funktionen und ihre Proliferationskapazität beibehielten. Die umprogrammierten Immunzellen wiesen eine deutliche Resistenz gegen die immunsuppressiven Kräfte auf, die typischerweise in der Mikroumgebung des Tumors vorhanden sind.

In präklinischen Modellen notorisch resistenter solider Tumoren zeigten die modifizierten CAR-T-Zellen eine deutlich verbesserte Fähigkeit, in Tumormassen einzudringen und ihre Anti-Krebs-Aktivität über längere Zeiträume aufrechtzuerhalten. Dies führte zu einer tiefgreifenden Verzögerung der Tumorprogression und in einigen Fällen zu einer vollständigen Regression – Effekte, die bei herkömmlichen CAR-T-Therapien selten beobachtet werden. Neben ihrer verbesserten Wirksamkeit zeigten diese rezeptordefizienten CAR-T-Zellen auch eine überraschende Verringerung systemischer entzündlicher Nebenwirkungen, einer häufigen Komplikation zellulärer Immuntherapien.

Die Strategie ergibt sich aus einem umfassenden Verständnis der vielfältigen Rolle von PGE2 in der Tumorbiologie und der Immunumgehung. Durch die Deaktivierung zweier unterschiedlicher Rezeptoren gewährleistet der Ansatz eine umfassendere Blockade der immunsuppressiven Signale von PGE2, die andernfalls Interventionen umgehen könnten, die nur auf einen einzelnen Rezeptor abzielen. Detaillierte phänotypische Analysen ergaben, dass der dualer Rezeptor-Knockout die wesentlichen Rezeptorsignalpfade nicht beeinträchtigte, die für die normale T-Zell-Funktion und -Navigation verantwortlich sind, wodurch die Fitness und Belastbarkeit der therapeutischen Zellen in vivo erhalten blieb.

Weitere tiefgehende molekulare Profilierungen verdeutlichten, wie die Deaktivierung der PGE2-Rezeptoren das Transkriptom der CAR-T-Zellen in Richtung eines stärker aktivierten und persistenteren Zustands rekallibriert. Dieser ist durch die Hochregulierung von Effektormolekülen und Resistenz gegen Erschöpfung (Exhaustion) gekennzeichnet – ein chronischer Dysfunktionszustand, der die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen häufig einschränkt.

In parallelen Entwicklungen haben Forscher rationales Design und bibliotheksbasierte Optimierung einer Protein-Protein-Interaktion menschlichen Ursprungs kombiniert, um Venetoclax-gesteuerte, arzneimittelregulierte Off-Switch PPI (DROP)-CARs zu entwickeln. Die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zell-Therapie wird durch On-Target-Off-Tumor-Toxizitäten und zelluläre Erschöpfung aufgrund chronischer Antigenexposition eingeschränkt. DROP-CARs ermöglichen die dosisabhängige Freisetzung des tumorgerichteten scFv und eine konsequente Verringerung der T-Zell-Bindung an die Tumorzelle.

Die meisten derzeit in der Klinik verwendeten CARs gehören der zweiten Generation (2G) an und bestehen aus einer Antigen-bindenden Komponente (typischerweise ein einzelkettiges variables Fragment, scFv), das mit einem Hinge-Bereich, einer Transmembranregion und den Endodomänen eines kostimulatorischen Rezeptors sowie von CD3ζ fusioniert ist. Zu den Einschränkungen der 2G-CARs gehört, dass eine chronische Antigenexposition die manipulierten T-Zellen erschöpfen kann, Toxizität durch On-Target-Reaktivität gegen gesundes Gewebe entstehen kann und eine Überreaktion bei hoher Antigendichte oder Tumorlast unerwünschte Ereignisse wie das Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) auslösen kann.

On-Switch- und Off-Switch- CAR-Designs, die eine Fernsteuerung des Aktivitätsniveaus der T-Zellen durch die Verabreichung kleiner Moleküle ermöglichen, stellen eine vielversprechende Strategie dar, um Funktion und Sicherheit in Einklang zu bringen. Obwohl es auf diesem Gebiet bemerkenswerte Fortschritte gibt, sind Switch-Designs, die auf menschlichen Domänen basieren (um die Immunogenität zu minimieren) und auf klinisch zugelassene kleine Moleküle reagieren, selten, und bestehende Designs weisen Einschränkungen auf.

Das Venetoclax-gesteuerte DROP-CAR-System wurde durch rationales Proteindesign und Bibliotheksscreening entwickelt, um eine stabile Protein-Protein-Interaktion menschlichen Ursprungs zu erzeugen, die durch das klinisch zugelassene Molekül Venetoclax effizient unterbrochen werden kann. Die Forscher präsentierten den Proof-of-Concept für ein duales DROP-CAR, das durch verschiedene kleine Moleküle gesteuert wird, sowie für logikgattergesteuerte synthetische Rezeptoren, die eine STAT3-Signalisierung ermöglichen. Sie demonstrierten die In-vitro- und In-vivo-Funktion von DROP-CAR-T-Zellen.

Forscher der Texas A&M University haben zwei neue CIP-Systeme (chemically induced proximity) zur Steuerung der Genexpression entwickelt. Das Team entwickelte ein Koffein-induzierbares System, das krebsspezifische Signalwege verändern und – in unveröffentlichter Forschung – die CRISPR-Maschinerie modulieren kann. Das andere System ist ein modifiziertes Rapamycin-CIP, das die CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) ausschalten kann, um das Risiko von Off-Target-Effekten zu verringern.

Das Koffein-gesteuerte System namens CHASER wurde entwickelt, indem ein bestehendes CIP-System namens „COSMO“ in den Nanobody LaM8 eingefügt wurde, damit dieser allosterisch auf Koffein reagieren kann. Mit der CHASER-Plattform war das Team in der Lage, Koffein zu nutzen, um die Expression von Tyrosin-Rezeptor-Kinasen (TRKs) in Zellkulturen zu induzieren und zu verändern. TRKs sind integrale Transmembranproteine, die an der zellulären Signalisierung sowie an der Tumorproliferation und Metastasierung beteiligt sind.

Das Team kann CRISPR in zwei separate Teile spalten und jedes Teil an Koffein-reaktive Module hängen. Wenn Koffein hinzugefügt wird, schnappen die beiden Teile zusammen, bauen das vollständige CRISPR-System wieder auf und schalten es ein. CRISPR wird nur aktiv, wenn Koffein vorhanden ist, was eine einfache und kontrollierbare Möglichkeit bietet, die Geneditierung ein- und auszuschalten. In der Veröffentlichung wird berichtet, dass das Team in Zellkulturen sogar verdünnten Tee, Kaffee und Red Bull verwendet hat, um die CHASER-vermittelte Genaktivierung auszulösen.

Das Team transformierte und reprogrammierte zudem ein Rapamycin-induziertes CIP namens UniRapR in einen genetischen „Aus-Schalter“ namens RASER, der ebenfalls auf LaM8-Nanobodies basiert. Während CHASER eine engere Konformation zweier Proteine induziert, bringt RASER zwei Domänen so zusammen, dass die Interaktion zwischen den Proteinen unterbrochen wird. Das Team untersuchte eine Reihe von RASER-Nanobody-Kandidaten in vitro unter Verwendung von Fluoreszenz als Indikator und entschied sich für ein spezifisches Design, das in ihrem Zellmodell zu einer um fast 70 % geringeren GFP-Expression führte.